Papel de ureases na nodulação de Glycine max por Bradyrhizobium japonicum

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Silva, Monica de Medeiros
• Orientador(a): Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Glycine max; Bradyrhizobium japonicum; Urease; Nodulacao
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/90467

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana.