Atividade antibiofilme e antibiótica da cera dos ovos e de metabólitos produzidos por bactérias associadas ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Zimmer, Karine Rigon
• Orientador(a): Termignoni, Carlos
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Rhipicephalus microplus; Pseudomonas aeruginosa; Tritrichomonas foetus; Carrapatos; Biofilmes
• Palavras-chave em Inglês: Rhipicephalus (Boophilus) microplus; Eggs; Biofilm inhibition; N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/69694

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes.