Uso da bioengenharia para produzir substitutos cutâneos, por meio do cultivo de células-tronco e queratinócitos em matrizes nanoestruturadas produzidas por eletrospinning

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Steffens, Daniela
• Orientador(a): Pranke, Patricia Helena Lucas
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Materiais biocompatíveis; Células-tronco; Laminina; Queratinócitos; Pele; Regeneração; Engenharia tecidual
• Palavras-chave em Inglês: Tissue engineering; Electrospinning; Scaffolds; Stem cells; Keratinocytes; Skin
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/249528

A engenharia de tecidos (ET) é uma ferramenta importante para a regeneração da pele. Os tratamentos disponíveis não são suficientes para evitar a formação de cicatriz e promover a cura do paciente. Portanto, o presente estudo teve por objetivo produzir um substituto cutâneo usando o polímero Poli-D,L-ácido láctico (PDLLA) para produzir o biomaterial. Para esta proposta, biomateriais foram construídos pela técnica de electrospinning e divididos em 3 grupos: 1) PDLLA, 2) PDLLA/NaOH (scaffolds de PDLLA cuja superfície foi hidrolisada com uma solução de NaOH a 0,75 M) e 3) PDLLA/Lam (scaffolds também hidrolisados com NaOH e com a ligação covalente da proteína laminina). Os biomateriais foram construídos com dois diâmetros diferentes de fibras, com a menor na parte superior das matrizes. Esses biomateriais foram caracterizados quanto à morfologia, o diâmetro da fibra, o tamanho dos poros, à degradabilidade e às suas características de hidrofilicidade. A ligação da laminina também foi investigada. Para as análises biológicas, as células-tronco mesenquimais (CTMs) foram então semeadas na parte inferior do scaffold e, após 24 horas, os queratinócitos da pele foram semeados na superfície oposta. Os grupos foram avaliados quanto à adesão de células no dia da semeadura e nos dias 7, 14 e 21 para análise da viabilidade celular. A partir do dia 7, os scaffolds foram submetidos a um sistema de cultura ar/líquido. Por fim, experimentos in vivo também foram realizados utilizando camundongos nude como modelo animal de queimadura. Seis grupos foram testados: (1) grupo lesão, onde os animais foram lesionados e uma gaze foi utilizada como cobertura (n=4); (2) PDLLA/Lam, scaffold hidrolisado com a ligação da laminina, sem células; (3) PDLLA sem células, (4) PDLLA/Lam com células; (5) PDLLA com células (n=6/grupo) e (6) animais saudáveis (n=4). Todos os animais receberam o mesmo padrão de defeito de 1cm2 , realizado no dorso dos animais, com exceção do grupo 6. Após a cirurgia, os animais foram acompanhados por um período de 9 dias. As fotografias foram obtidas no dia da cirurgia e no dia da eutanásia. Após esse período, metade da lesão foi utilizada para análise de histologia e a outra metade para a análise de expressão gênica. Como resultados, os scaffolds apresentaram-se com fibras bem formadas e aleatoriamente distribuídas. A hidrólise não afetou substancialmente a estrutura das fibras, mas foi suficiente para a ligação da laminina. O diâmetro das fibras grossas variou de acordo com o scaffold, ficando entre 3,197 a 4,622 µm. O tamanho dos poros também variou de acordo com o biomaterial, ficando de 19,182 a 27,732 µm. As fibras finas apresentaram diâmetro médio de 574 nm e tamanho médio de poro de 3,444 µm. O biomaterial de PDLLA/Lam mostrou as características mais hidrofílicas entre os três grupos analisados. Matrizes de PDLLA apresentaram peso molecular de 105-87 Da no 14º dia de análise. As matrizes de PDLLA/NaOH e PDLLA/Lam apresentaram peso molecular de cerca de 40-50 Da, resultante do processo de hidrólise. A ligação da laminina foi confirmada por ensaio de imunofluorescência. Em geral, em termos de análise biológica, o grupo de PDLLA/Lam apresentou os melhores resultados para a adesão e viabilidade celular. A presença de ambos os tipos de células foi observada por meio da análise histológica em todos os grupos de scaffolds (ou biomateriais), até 21 dias de cultivo. Além disso, observou-se claramente que as células ocuparam toda a estrutura das matrizes, em todos os grupos estudados. Após 9 dias de experimentos in vivo, não houve diferença estatística no tamanho do defeito entre os grupos, embora os grupos com o biomaterial PDLLA/Lam tenham tido uma tendência ao menor tamanho de lesão, assim como o grupo PDLLA/Lam apresentou o melhor aspecto visual da ferida. A análise da expressão gênica para os grupos de biomateriais mostrou aumento considerável da expressão de TGFβ1, aumento de VEGF e balanço (ou equilíbrio) da razão BAX/Bcl-2, quando comparado ao grupo controle lesão. A análise histológica mostrou tecidos bem formados nos grupos onde biomateriais e biomateriais com células foram utilizados. Em alguns animais do grupo biomateriais com células, a epiderme foi formada em toda a extensão da ferida. Não houve formação de anexos de pele em nenhum dos animais testados. Em conclusão, os biomateriais, principalmente os grupos PDLLA e PDLLA/Lam, mostraram bons resultados para a co-cultura das células, com boa adesão celular e a presença de células viáveis. Esses biomateriais foram capazes de proporcionar o suporte para o crescimento das células, o que indica que eles podem ser biomateriais adequados para utilização na engenharia de tecidos.