Estudos epigenéticos em Drosophila : uma análise evolutiva multinível da enigmática enzima DNMT2

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Vieira, Gilberto Cavalheiro
• Orientador(a): Gaiesky, Vera Lúcia da Silva Valente
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Drosophila willistoni; Enzima DNMT2; Epigenética
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/202687

Fundamentalmente, o processo epigenético caracteriza-se por contribuir com diferentes fenótipos alternativos emergindo em um organismo a partir de seu genótipo. Os mecanismos envolvidos na modulação da expressão dos genes são amplamente estudados, especialmente em vertebrados (mamíferos). Podemos dividir esses mecanismos epigenéticos de três formas: (i) modificação de citosinas genômicas; (ii) modificação pós-tranducional das caudas de histonas; e (iii) controle de transcritos mediados por RNAs não-codificantes. Desses três mecanismos descritos, a modificação de citosinas genômicas por meio da metilação é a mais bem estudada. Apesar do amplo conhecimento que se estabeleceu sobre as funções e impactos da metilação em mamíferos nos aspectos fisiológicos e ontogenéticos, em invertebrados ainda residem diversas questões a serem elucidadas. Como Drosophila possui apenas a DNA metiltransferase 2 (Dnmt2), é reconhecida como organismo “Dnmt2-only”. Os padrões de metilação de citosinas nesse grupo de organismos possui destacadas diferenças em relação aos demais organismos que possuem as DNA metiltransferases canônicas (Dnmt1 e Dnmt3). Assim, a presente tese apresenta em um primeiro momento, extensivo estudo sobre a conservação e evolução da Dnmt2 em drosofilídeos. Para isso, utilizamos aproximadamente 70 espécies de Drosophilidae. Como resultado das análises filogenéticas, os principais clados de Drosophilidae foram recuperados, onde observamos claramente as relações evolutivas entre o subgênero Drosophila e Sophophora e suas espécies. Analisamos quais as forças evolutivas conduziram a história da Dnmt2 dentro do gênero Drosophila e observamos que em Dnmt2 de drosofilídeos há forte ação de seleção purificadora. Entretanto, seis sítios apresentaram sinais de seleção positiva e doze outros sítios, seleção positiva desbalanceadora - favorecendo mudanças estruturais e funcionais na enzima Dnmt2. Destacamos a alta taxa de substituição nucleotídica por códon no clado das espécies do subgrupo willistoni. Além disso, aprofundamos os estudos sobre os aspectos evolutivos dentro do contexto epigenético, analisando possíveis proteínas que interajam, direta ou indiretamente, com a Dnmt2. Ao todo, quinze proteínas compartilham significativa taxa de covariação evolutiva com Dnmt2, sugerindo serem potenciais parceiras em diferentes redes de controle de expressão gênica. A relevância de um gene pode ser aferida, entre diversas formas, por seu padrão de expressão ao longo da ontogenia do organismo. Como D. willistoni se destaca por suas peculiaridades no âmbito epigenético, em um segundo momento, procuramos analisar os 12 padrões dos níveis transcricionais e localizar o gene Dnmt2 através de hibridação in situ em cromossomos politênicos. Verificamos que o gene Dnmt2 de D. willistoni possui maior nível transcricional nos estágios iniciais, diminuindo o com o avançar do desenvolvimento. Interessantemente, os dados obtidos por qPCR em adultos de D. willistoni, sugerem que esses possuem níveis de expressão levemente maiores do que aqueles observados em estudos prévios com D. melanogaster. Também detectamos transcritos de Dnmt2 já no período da oogênese, o que pode ser um indicativo que esse seja de origem materna. O gene Dnmt2 se encontra em região subtelomérica do braço IIL (Elemento B de Muller, comprovando sintenia cromossômica com outras 12 espécies de Drosophila). A localização de Dnmt2 é por si só interessante, pois genes localizados em regiões próximas aos telômeros (e centrômeros) possuem características evolutivas marcadamente distintas das demais regiões cromossômicas, o que pode estar relacionado com as diferenças quanto aos aspectos evolutivos moleculares descritos previamente em D. willistoni. Por fim, nas duas últimas etapas analisamos as propriedades físico-químicas emergentes da estrutura terciária de diversas Dnmt2, com especial atenção à região responsável pelo reconhecimento da sequência alvo a ser metilada (TRD). Utilizamos para esse estudo as Dnmt2 de procariotos HhaI e HaeIII, do gênero Haemophilus (reconhecidas por serem DNA metiltransferases), a Dnmt2 de Geobacter sulfurreducens, de Entamoeba histolytica, de Spodoptera frugiperda e humana (todas com afinidade por tRNA) e vinte e seis modelos gerados por meio de modelagem molecular por homologia estrutural de drosofilídeos. Constatamos que mutações em sítios da TRD modificam o perfil de distribuição de cargas eletrostáticas de superfície (CES) e, consequentemente, a atividade cinética da enzima junto ao substrato. Observamos que mesmo entre espécies próximas (drosofilídeos), as CES são diferentes. D. willistoni apresenta características em seu perfil de CES que a diferencia das demais espécies de Drosophila e a aproxima dos valores de cinética enzimática encontrados experimentalmente em HhaI. Através de simulações de dinâmica molecular do complexo Dnmt2-DNA de HhaI, E. histolytica, S. frugiperda, D. melanogaster, D. willistoni e Dnmt2 humana, constatamos que as diferenças encontradas nas CES das TRDs refletem diretamente mudanças nas dinâmicas entre enzima e ligante. A Dnmt2 de D. willistoni é a enzima eucariótica que apresentou o maior número de ligações de Hidrogênio estáveis com DNA, comportamento similar ao encontrado no complexo HhaI-DNA, reconhecidamente uma DNA metiltransferase.