Avaliação e validação da utilidade clínica do sequenciamento de nova geração (NGS) para confirmação do diagnóstico de doenças lisossômicas selecionadas

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Málaga, Diana Elizabeth Rojas
• Orientador(a): Giugliani, Roberto
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Palavras-chave em Português: Erros inatos do metabolismo; Doencas lisossomicas de deposito : Diagnostico
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/193658

Introdução: As doenças lisossômicas (DLs) são patologias genéticas que, apesar de serem classificadas como raras, acometem uma significativa porcentagem da população. Muitos fatores tornam seu diagnóstico desafiador, entre eles a variabilidade no fenótipo, com poucos sinais e sintomas clínicos específicos. O desenvolvimento de ferramentas inovadoras de investigação, destacando-se os novos métodos de sequenciamento massivo, reduziria a “odisseia diagnóstica” enfrentada pelo paciente e sua família, proporcionaria um diagnóstico mais precoce com melhor resultado no tratamento nas situações em que há terapia disponível, além de um adequado aconselhamento genético. A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing, NGS) tem claras vantagens sobre as técnicas de sequenciamento convencional, oferecendo um alto rendimento diagnóstico ao permitir definir um espectro mutacional abrangente. O NGS permite o sequenciamento de vários genes simultaneamente com custo global relativamente baixo, tornando painéis de genes uma alternativa atrativa para o screening genético. Esta abordagem é capaz de detectar, de maneira altamente específica, variantes missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels, e algumas grandes deleções em homozigose ou hemizigose. No entanto, para que essa tecnologia seja aplicável à prática clínica, é necessária uma etapa de validação prévia para a determinação dos parâmetros críticos de análise desde o processamento da amostra até a análise e interpretação de dados. Após a validação dos métodos, será possível a avaliação da utilidade clínica de painéis NGS para diversas aplicações, incluindo seu uso como método confirmatório nos casos de triagem neonatal alterada para doenças lisossômicas. Objetivos: 1) Desenhar e validar uma estratégia baseada no NGS para a análise de 24 genes, incluídos em 3 painéis distintos de acordo com parâmetros pré definidos, e associados com 22 DLs; 2) Avaliar a qualidade e eficiência do ADN extraído de sangue impregnado em papel filtro (SIPF) para uso no NGS; 3) Avaliar a utilidade clínica do NGS para: a) diagnóstico molecular, b) diagnóstico diferencial e, c) confirmação diagnóstica de casos alterados na triagem neonatal para pelo menos 4 dessas condições (doença de Gaucher, Fabry, Pompe e Niemann-Pick tipo A/B). Metodologia: Estudo descritivo, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico das DLs estudadas. Foi utilizada a plataforma NGS Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) para sequenciamento de três painéis de genes, desenhados através da ferramenta Ion AmpliseqTM Designer (Thermo Fisher Scientific). Para a validação foram incluídos pacientes com diagnóstico molecular prévio por sequenciamento de Sanger. Para a extração de ADN de SIPF, foi avaliado o método não comercial de fenol-clorofórmio. A utilidade clínica do NGS foi estabelecida através do: a) diagnóstico molecular de um grupo de pacientes com suspeita de lipofuscinose ceróide neuronal tipo 2 (CLN2) para o estabelecimento do genótipo (TPP1) associado à doença, assim como estabeleceu-se o diagnóstico molecular de outros pacientes com suspeita clínica e/ou bioquímica de algumas das DLs selecionadas, b) diagnóstico diferencial de um paciente utilizando um dos painéis NGS desenhados e, c) avaliação das amostras de recém-nascidos (obtidas em estudo paralelo) que tiveram resultados inicialmente alterados na triagem neonatal bioquímica para algumas das DLs selecionadas. Resultados: 1) Três painéis foram desenhados, cada um consistindo em dois pools de primers que amplificam as regiões codificantes e 20pb da junção exon-intron. Os painéis A, B e C têm amplitude de cobertura de 97.74, 99.6 e 98.38%, respectivamente. Nesta validação foi possível estabelecer a sensibilidade, especificidade e limitações de cada painel (Artigo 1); 2) foi estabelecida a metodologia para a extração de ADN para seu uso em vários processos moleculares downstream: PCR convencional, Real-Time PCR, PCR-RFLP, MLPA, Sequenciamento de Sanger e NGS na plataforma Ion Torrent PGMTM (Artigo 2); 3) A utilidade clínica dos painéis desenhados foi estabelecida através de: a) Genotipagem de 48 pacientes com suspeita clínica e bioquímica de CLN2 (painel C) (Artigo 4), e de 3 outros casos: 1 caso de Niemann-Pick tipo B (SMPD1) (painel B) e 2 casos de doença de Danon (LAMP2) (painel A) (Artigo 1), b) o diagnóstico diferencial foi realizado através do caso de um paciente com suspeita inicial de Niemann-Pick C que, após a análise molecular, foi diagnosticado com Niemann-Pick tipo B utilizando o painel B, (Artigo 1) c) a aplicabilidade dos painéis de genes para a confirmação diagnóstica em casos de triagem neonatal foi realizada em 2 casos com resultados alterados na triagem neonatal: um caso de Pompe (painel A) e outro de Gaucher (painel B) (Artigo 3 e Anexo I). Conclusão: A abordagem por NGS através do uso de painéis, foi capaz de identificar diferentes alterações genéticas nos genes estudados, incluindo variantes do tipo missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels. Estes painéis oferecem uma estratégia de triagem dos 24 genes associadas às DLs selecionadas. Este trabalho foi inovador ao utilizar o NGS para a análise molecular dos genes associados às DLs no Brasil; foi desenvolvido no Laboratório de Genética e Biologia Molecular do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, conhecido como um centro de referência em diagnóstico e pesquisa de DLs, e que atualmente tem os painéis NGS como principal ferramenta de diagnóstico molecular.