Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: |
2012 |
Autor(a) principal: |
Martinelli, Anne Helene Souza |
Orientador(a): |
Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva |
Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
Tipo de documento: |
Tese
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Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
Idioma: |
por |
Instituição de defesa: |
Não Informado pela instituição
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Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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Departamento: |
Não Informado pela instituição
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País: |
Não Informado pela instituição
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Palavras-chave em Português: |
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Link de acesso: |
http://hdl.handle.net/10183/90481
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Resumo: |
Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease. Esta toxicidade envolve a liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) da proteína, por ação hidrólitica de catepsinas encontradas no sistema digestivo de insetos suscetíveis. Baseado na sequência N-terminal do pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente (jaburetox-2Ec) foi clonado, a partir da sequência da JBURE-II, e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec (carregando epítopo V5 e cauda His) foi testado contra os insetos Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda e 100% de mortalidade foi observado em todos os modelos após a ingestão de microgramas do peptídeo. Outros dados mostram que jaburetox-2Ec tem capacidade de interagir com bicamadas lipídicas acídicas, permeabilizando lipossomas, além de atividade antifúngica. Estudos de modelagem do peptídeo revelaram a presença de um grampo beta, que poderia estar envolvido nesta toxicidade. A fim de estudar os motivos envolvidos nestas atividades biológicas, escolhemos uma abordagem de mutagênese dirigida. Para isto, a sequência de DNA do jaburetox foi clonado em plasmídeo pET-23a, obtendo-se a expressão do jaburetox, contendo apenas cauda de histidina, e a partir deste, obtivemos diferentes mutantes: 1) deleção de todo o grampo beta (aminoácidos 61-75); 2) deleção da metade N-terminal do peptídeo, que corresponde a uma região ausente nas ureases bacterianas; 3) deleção da metade C-terminal do peptídeo. Ensaios de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas artificiais com o jaburetox e mutantes mostraram que todos formam canais iônicos, ainda que com diferentes características. Bioensaios com o percevejo Oncopeltus fasciatus (injeção na hemocele) e leveduras mostraram que a região do grampo-beta não está envolvida nos efeitos do peptídeo nesses organismos, sendo que é a região Nterminal responsável pelas atividades inseticida e antifúngica do Jaburetox. |