Purificação e caracterização da urease recombinante de Proteus mirabilis

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Broll, Valquiria
• Orientador(a): Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Proteus mirabilis; Urease
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/84981

Ureases são metaloenzimas dependentes de níquel, amplamente distribuída em bactérias, fungos e plantas. Estas enzimas atuam na catálise da hidrólise da ureia a amônia e dióxido de carbono. Proteus mirabilis é uma bactéria patogênica, produtora de urease, um de seus mais importantes fatores de virulência. Esta bactéria Gram-negativa se comporta como um uropatógeno oportunista responsável por severas infecções em pacientes hospitalizados. A amônia liberada pela hidrólise da ureia catalisada pela urease de Proteus mirabilis (PMU) causa um aumento no pH levando à formação de microclima, possibilitando a colonização do patógeno no trato urinário do hospedeiro. A PMU apresenta alta similaridade com outras ureases, como a urease de sementes de “Jack bean” (JBU) e a urease de Helicobacter pylori (HPU), para as quais nosso grupo descreveu diversas atividades biológicas que são independentes da hidrólise de ureia. Neste trabalho, nós produzimos PMU, e logo depois investigamos se esta, assim como a JBU e a HPU, apresenta atividades não relacionadas à atividade enzimática. As condições de cultivo para expressão da PMU expressa em Escherichia coli HB101 foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta. Concentrações de níquel, ureia e tempos de indução foram testados. A purificação da enzima recombinante foi obtida em 3 etapas cromatográficas. A primeira, uma HiTrapQTM HP (pH 7,5) onde a urease foi eluida com 400 mMol.L-1 de KCl. O pico das frações eluídas foram reunidas, dialisadas e aplicadas na coluna HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP, usando o mesmo tampão e sal para eluição. As frações ativas foram novamente reunidas e a PMU foi submetida a cromatografia de gel filtração (Superdex 200TM 26/60-pg). A PMU apresenta estabilidade na faixa de pH 7,0 a 8,5, com seu pH ótimo estimado em 8,0. Alta atividade ureolítica pode ser detectada de 37 oC a 48 oC. Diferentes soluções salinas induzem o aumento na atividade enzimática desta urease, e quanto maior o tempo de exposição, maior a tendência a este aumento. Assim como a JBU, esta urease é capaz de inibir o crescimento de leveduras, mas diferentemente desta e da HPU, a PMU não apresenta atividade inibitória sobre a germinação de esporos e o crescimento de fungos filamentosos. As ureases de P. mirabilis e de H. pylori apresentam regiões de semelhança com o peptídeo proveniente do colágeno, e de acordo com testes de modelagem, esta região estaria exposta para interação com receptores localizados nas membranas de plaquetas, visto que ambas ativam plaquetas resultando na formação de agregados.