Estudo abrangente sobre a deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (Mucolipidoses II e III) : do diagnóstico molecular a propostas de tratamento

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Velho, Renata Voltolini
• Orientador(a): Schwartz, Ida Vanessa Doederlein
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Mucolipidoses; Fosfotransferase
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/119620

Introdução: Os lisossomos são organelas ácidas em que muitos tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídios são entregues para a degradação. A biogênese dos lisossomos requer a contínua substituição das enzimas lisossomais solúveis e das proteínas de membrana lisossomal. O direcionamento das hidrolases ácidas depende dos resíduos de manose-6-fosfato (M6P) que são reconhecidos por receptores específicos que medeiam o seu transporte para os lisossomos. O papel chave na formação destes resíduos é desempenhado no Complexo de Golgi pela enzima GlcNAc-1-fosfotransferase que contêm seis subunidades, α2β2γ2. Este complexo enzimático é codificado por dois genes, GNPTAB e GNPTG. Mutações nestes genes resultam em duas doenças lisossômicas, as mucolipidoses (ML) tipo II e III, caracterizadas bioquimicamente pela perda de múltiplas enzimas lisossomais, devido à formação deficiente dos resíduos de M6P. Objetivos: 1) Verificar a patogenicidade, por meio de ensaios in vitro, das seguintes mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G e c.3668_3670delCTA; 2) Caracterizar o perfil de mutações de GNPTG presente em uma amostra de pacientes com ML III gama; 3) Analisar o efeito de gentamicina e cloranfenicol sobre a atividade das enzimas α-manosidase, β-glicuronidase e β-galactosidase em fibroblastos de pacientes com ML III gama heterozigotos ou homozigotos para mutações sem sentido em GNPTG. Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II/III. Mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II/III alfa/beta foram estudas em relação a expressão de mRNA, proteína, atividade enzimática e localização intracelular da GlcNAc-1-fosfotransferase. Pacientes também foram avaliados quanto a variações no gene GNPTG e seus possíveis impactos a nível de mRNA. O grupo de pacientes com ML III gama foram avaliados para medir sua independência funcional “Functional Independence Measure” (FIM). Estudos de expressão de GNPTAB e GNPTG também foram desenvolvidos para maior compreensão da relação destes genes. O desenvolvimento de um possível tratamento realizado nos fibroblastos de pacientes com ML III gama também foram objeto de estudo. Resultados: Mutações sem sentido e que alteram a fase de leitura da enzima GlcNAc-1-fosfotransferase não são corretamente transportados do retículo endoplasmático (RE) ao aparelho de Golgi, devido a interrupção, a falta dos sinais de exportação localizados nas porções N- e C- terminais da proteína. O não transporte ao Golgi e consequentemente, a ausência da clivagem proteolítica da proteína precursora das subunidades α/β, são responsáveis pela falta de atividade enzimática. Além dessas, mutações com sentido trocado na porção luminal da enzima também podem ter o transporte ao Golgi prejudicado, o que sugere a presença de um local de contato para uma proteína necessária para a exportação eficiente do RE. O estabelecimento de um ensaio radioativo para medir a atividade enzimática da GlcNAc-1-fosfotransferase confirmou que o transporte para o Golgi e a clivagem proteolítica nas subunidades α- e β- maduras é um pré-requisito para a atividade enzimática. As mutações em GNPTAB tiveram sua patogenicidade confirmada. Em relação a análise de GNPTG, as técnicas moleculares empregadas permitiram a identificação de três novas mutações patogênicas (c.244_247dupGAGT, c.328G>T e c.233+5G>C) e de uma outra variação (c.-112C>G). Após incessante investigação do trio cuja mutação causal c.244_247dupGAGT foi encontrada, a mesma foi atribuída como um evento de novo que ocorreu em um único óvulo ou de um mosaicismo germinativo no óvulo materno. Ao investigar o potencial efeito das mutações sem sentido através de mRNA, não foi possível identificar a mutação c.328G>T (p.E110X), no lugar desta, todos os pacientes apresentaram a sequência selvagem de GNPTG, evento denominado edição de RNA (c.328G@T). Porém, níveis de mRNA muito próximos a zero foram obtidos o que confirma a patogenicidade das mutações em GNPTG bem como o diagnóstico dos pacientes. Em pacientes ML II e III alfa/beta e em ML III gama, a redução dos níveis de mRNA de GNPTAB e GNPTG, respectivamente, pode ser facilmente explicada pela natureza das mutações identificadas nos pacientes. O que intriga, porém, é a expressão do gene não mutado. A divergência entre os resultados encontrados pode estar relacionada ao tipo de amostra, sabendo-se que as ML II e ML III são tecido-específicas. Fibroblastos de três pacientes com ML III gama portadores de mutações sem sentido foram tratados com geneticina e cloranfenicol. Este estudo de conceitos não demonstrou a possibilidade ou eficácia de um tratamento ser desenvolvido baseado na utilização de compostos não antibióticos atuarem sobre a tradução alternativa ou read through em pacientes com ML II e III. Conclusão: Estudos de caracterização genética, clínica e populacional sempre contribuirão para a elucidação dos mecanismos da doença e concomitantemente, melhor atendimento ao paciente. Com isto, é de grande importância que esforços e recursos sejam destinados a pesquisas nesta área para o completo entendimento das ML II e III e dos processos biológicos envolvidos. Este é o primeiro estudo brasileira a realizar o diagnóstico molecular de ML III gama; o primeiro a relatar uma mutação de novo e também, a ocorrência de edição de mRNA em pacientes com ML III gama.