A enzima beta-cetoacil-PCA redutase de Mycobacterium tuberculosis H37Rv: mecanismos cinético, químico e cooperativo

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Silva, Rafael Guimaraes da
• Orientador(a): Basso, Luiz Augusto
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Enzimas : Bioquímica; Mycobacterium tuberculosis; Tuberculose
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/13852

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados.