Estudo das propriedades cinéticas da enzima quitotriosidase humana e dos parâmetros pró-inflamatórios interleucina 6 e fator de necrose tumoral alfa em plasma de pacientes com as doenças de Gaucher tipo I, Krabbe e gangliosidose GM1 e de heterozigotos para a doença de Gaucher tipo I : comparação com indivíduos normais

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Wajner, Alessandro
• Orientador(a): Coelho, Janice Carneiro
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Quitotriosidase; Doença de Gaucher; Doença de Krabbe; Gangliosidose GM1; Doenças por armazenamento dos lisossomos
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/194111

Um aumento acentuado da atividade da quitotriosidase (QT) tem sido encontrado em plasma de pacientes afetados por várias esfingolipidoses, incluindo a doença de Gaucher tipo I (DG), a doença de Krabbe (DK) e a gangliosidose GM1 (GM1). Na DG, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase, a QT é considerada um marcador auxiliar no diagnóstico desta enfermidade. Já nas DK e GM1 causadas, respectivamente pelas deficiências na atividade das enzimas galactosilceramidase e b-galactosidase, há um aumento moderado da atividade da QT. O objetivo inicial do presente trabalho foi o de caracterizar as propriedades cinéticas da enzima quitotriosidase em plasma de pacientes com as DG tipo I, DK, GM1 e heterozigotos para a DG tipo I (HG), bem como comparar essas propriedades entre os vários grupos e com as de indivíduos normais. Verificamos inicialmente que nos pacientes com DG tipo I a atividade plasmática da QT apresentou-se muito acima da normalidade (em média 600 vezes), o mesmo ocorrendo em indivíduos com DK (em média 12 vezes) e com GM1 (em média 15 vezes). No que se refere às propriedades cinéticas, observamos que o pH ótimo da QT dos pacientes com DK e GM1 foi superior ao dos controles, enquanto a QT de homozigotos (DG) e heterozigotos para DG (HG) teve um pH ótimo inferior ao dos controles. Além disso, o maior Km observado para a QT foi observado em pacientes com GM1, seguido daquele com DG, que foram muito superiores aos Km de todos os outros grupos (DK, HG e controles), refletindo uma menor afinidade da enzima pelo substrato nos pacientes com GM1 e DG. Além disso, o Km dos pacientes com DK e HG foram, respectivamente, superior e inferior ao dos controles. Já no que se refere à velocidade máxima (Vmax) observou-se um aumento acentuado desse parâmetro no grupo DG tipo I, seguindo-se do GM1 e DK, relativamente aos grupos controle e HG. Esses achados foram semelhantes aos encontrados para a atividade da QT nos grupos estudados. Finalmente verificamos que a QT de indivíduos normais é muito mais termoestável relativamente à QT dos pacientes com DG tipo I, DK e GM1, bem como ao grupo HG. É possível que as variações das propriedades cinéticas da QT entre os vários grupos analisados em relação aos controles e também aos HG possam potencialmente representar marcadores bioquímicos simples e rápidos na diferenciação de indivíduos homozigotos para algumas dessas doenças lisossomais, bem como de HG com indivíduos normais. Estes resultados indicam, portanto, que indivíduos normais podem ser diferenciados dos HG através do pH ótimo, Km e termoestabilidade da QT. O próximo objetivo de nossa investigação foi comparar as propriedades cinéticas da quitotriosidase em pacientes com a DG tipo I não tratados e em tratamento com terapia de reposição enzimática. Verificamos que a atividade da enzima apresentou um decréscimo ao longo do tratamento e que o Km se elevou significativamente em relação àquele do início do tratamento, enquanto as outras propriedades (Vmax, pH ótimo e termoestabilidade) não foram alteradas. Embora não se tenha uma explicação no momento para o aumento do Km com o tratamento, podemos supor que isoenzimas da QT com uma afinidade menor ao substrato (maior Km) pudessem ser mais expressas no sangue dos pacientes tratados. Também medimos e comparamos os níveis dos fatores pró-inflamatórios interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) no plasma de pacientes com DG tipo I, DK, GM1, HG e de indivíduos normais. Observamos que tanto a IL-6 quanto o TNF- apresentaram concentrações plasmáticas aumentadas nos pacientes com DG tipo I, DK e GM1, bem como nos HG relativamente aos controles. O aumento verificado nas concentrações plasmáticas de TNF- nos pacientes afetados por DG tipo I, GM1 e DK foi aproximadamente de 3 a 4 vezes superior ao dos controles. Já as concentrações plasmáticas de IL-6 nesses mesmos pacientes foram superiores a dos controles na ordem de magnitude de 3 (DG tipo I e HG), 5 (GM1) e 15 (DK) vezes, indicando que esse parâmetro é mais sensível que o TNF- na diferenciação entre os indivíduos normais e os com as doenças lisossomais estudadas. Esses achados indicam uma ativação do sistema imunológico a nível sistêmico nos pacientes com as doenças lisossomais acima descritas, bem como nos HG. Além disso, observamos que os níveis plasmáticos de IL-6 e TNF- não estavam correlacionados com a atividade e as propriedades bioquímicas da QT, bem como com as atividades da -glicosidase, galactocerebrosidase e -galactosidase, indicando que o processo inflamatório sistêmico detectado no plasma dos pacientes com DG tipo I, DK e GM1 por níveis elevados de IL-6 e TNF- não está associado à atividade ou às propriedades cinéticas da QT e com a atividade das enzimas deficientes nestas doenças. Também investigamos associações entre o sexo, algumas manifestações clínicas comuns encontradas nos pacientes com DK, GM1 e entre a atividade e as propriedades cinéticas da QT com os níveis das citocinas IL-6 e TNF- em plasma desses indivíduos. Verificamos que o sexo não alterou significativamente nenhum desses parâmetros. Já nos pacientes com GM1 a presença de hepatomegalia associou-se a uma elevação da atividade e da Vmax da QT, indicando que esse sinal clínico possa estar relacionado a uma ativação do sistema imunológico. Ainda nos pacientes com GM1, foi verificado que a presença de convulsões nos mesmos associou-se a uma menor Vmax da QT e a níveis baixos de TNF- . Nenhuma outra associação significante nesses parâmetros pode ser verificada nos pacientes com DK e GM1.