Segregação de células somáticas seminais de bovinos e ovinos frente a diferentes diluentes para resfriamento e congelamento de sêmen

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Feijó, Ana Laura da Silva
• Orientador(a): Bertolini, Marcelo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Separação celular; Células somáticas; Espermatozóides; Diluente de esperma; Refrigeração; Congelamento; Glicerol; Bovinos; Ovinos
• Palavras-chave em Inglês: Cell segregation; Percoll® gradient; Glycerol; Semen; Cattle; Sheep
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/243112

A ocorrência de células somáticas no sêmen possibilita seu uso para a produção in vitro (PIV) de embriões pela clonagem animal por transferência nuclear de célula somática (TNCS). Visando o melhor aproveitamento desta fonte de material biológico, Nel-Themaat e colaboradores propuseram em 2008 um protocolo com o gradiente de Percoll® que possibilita o isolamento de células somáticas seminais (CSS) e espermatozoides (STPZ) de uma mesma dose de sêmen para uso na clonagem animal e na fecundação in vitro (FIV), respectivamente. Porém, ao aplicarmos tal protocolo para o sêmen bovino e ovino, observamos diferentes resultados de segregação celular, dependendo das características da amostra. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes diluentes para refrigeração e congelamento de sêmen bovino e ovino frente ao processo de segregação de CSS e SPTZ viáveis utilizando um gradiente de Percoll®. Para tanto, foi utilizado o sêmen de três carneiros cruzas Texel e de quatro touros Brangus, todos machos adultos e férteis. O ejaculado de cada macho foi dividido em oito grupos, sendo uma amostra de sêmen fresco e sete amostras diluídas em cinco diluentes comuns para ambas as espécies (Tris-Gema, TG; Citrato-Gema, CG; Tris-Gema-Glicerol, TGG; Citrato-Gema-Glicerol, CGG; e um diluente comercial), e em dois diluentes específicos para cada espécie (Leite Desnatado, LD e Leite Desnatado-Glicerolado, LDG, para ovinos; ou Lactose-Gema, LG e Lactose-Gema-Glicerol, LDG, para bovinos), para a refrigeração por 24 h (diluentes sem glicerol TG, CG, LD) ou para a congelação (diluentes com glicerol TGG, CGG, LDG, comercial). A avaliação do perfil de segregação de CSS foi realizada após a coleta do sêmen fresco (-3 h), quando o sêmen diluído atingiu o equilíbrio a 5ºC (0 h), e 24 h após o equilíbrio a 5ºC (sêmen refrigerado), ou após o descongelamento (sêmen congelado). Cada uma das oito amostras distintas de cada ejaculado, nos diferentes tempos, foi submetida à centrifugação para a segregação celular em gradiente de 20/50/90% de Percoll®. Cada amostra foi então coletada em quatro frações do gradiente, sendo a FTI a fração superficial do gradiente de 20% de Percoll®; a FTII a fração entre os gradientes de 20% e 50% de Percoll®; a FTIII a fração remanescente do gradiente de 50% de Percoll®; e a FTIV a fração contendo o pellet formado no gradiente de 90% de Percoll®. Cada fração foi analisada quanto à presença de CSS, espermatozoides e debris celulares, com os dados analisados por ANOVA e Tukey, e pelos testes de Kruskal-Wallis, X2 e correlação simples de Pearson (P<0,05). Nos ovinos e bovinos, não houve diferença no número total de CSS obtidas entre os diluentes, em cada tempo de análise (0 h e 24 h), mas houve diferença entre diluentes quanto à segregação de acordo com as frações de Percoll®, indicando uma migração celular distinta entre os diluentes, para cada espécie, sendo em geral semelhantes entre os tempos, para o mesmo diluente. Em ovinos, o diluente à base de leite desnatado, quando sem glicerol, rendeu um elevado número e proporção de CSS na FTI (LG, 78,1%), enquanto que a adição de glicerol concentrou as CSS na FTII (LDG, 70,5%). Já o sêmen fresco e os diluentes com gema de ovo e sem glicerol apresentaram um maior número e proporção de CSS na FTIII (Fresco, 61,9%; CG, 68,1%; TG, 68,3%). A adição de glicerol ao citrato-gema (CGG) concentrou as CSS na FTII (62,5%). Por fim, os diluentes TGG e o comercial segregaram as CSS na FTIV no t=0 h (64,6% e 66,6%, respectivamente) e na FTIII no t=24 h (70,2% e 50,7%, respectivamente). Em bovinos, o sêmen fresco e o diluente CG concentraram as CSS na FTI (49,1 e 57,5%), enquanto os diluentes TG e LG concentraram as CSS na FTIII (TG, 60,7%) e FTIV (LG, 68,0%). A adição de glicerol alterou o perfil de migração do TGG para a fração FTIV (52,1%) e do LDG para a FTIII (63,9%). O diluente comercial, com glicerol, segregou as CSS em maior proporção nas frações FTIII (31,1%) e FTIV (44,6%). Já o diluente CGG, com glicerol, segregou as CSS na FTIII no t=0 h (46,7%) e na FTIV no t=24 h (42,0%). Em resumo, concluímos que a migração das CSS (número e proporção por frações) se manteve semelhante entre os animais de cada espécie. Porém, a proporção de CSS segregadas dos ejaculados de bovinos e ovinos utilizando o gradiente de Percoll® foi influenciada pela composição do diluente, em especial pelo uso da gema de ovo ou do leite desnatado, e principalmente pela presença ou não de glicerol nos diluentes.