Caracterização molecular de isolados da família Enterobacteriaceae produtores da β-Lactamase OXA-370

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Magagnin, Cibele Massotti
• Orientador(a): Zavascki, Alexandre Prehn
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Enterobacteriaceae; Anti-infecciosos; Carbapenêmicos; Beta-lactamases
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/179051

Base teórica: As carbapenemases são β-lactamases capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, importante opção terapêutica nas infecções causadas por enterobactérias. A carbapenemase OXA-48 e suas variantes estão entre as principais carbapenemases encontradas em Enterobacteriaceae disseminadas em todo o mundo. A OXA-370, que difere da OXA-48 por um único aminoácido, foi detectada pela primeira vez em 2013 na cidade de Porto Alegre, e até o momento só há relatos de sua detecção no Brasil. Objetivos: Caracterizar isolados produtores de OXA-370 quanto ao perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos, sobretudo carbapenêmicos, e investigar o contexto genético em que o gene blaOXA-370 está inserido. Métodos: Foram avaliados isolados obtidos a partir de um estudo de vigilância para o monitoramento de enterobactérias com sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. A detecção dos genes de carbapenemases (blaIMP, blaKPC, blaGES, blaNDM, blaOXA-48-like e blaVIM) foi realizada por PCR Real Time HRM. Os isolados positivos para blaOXA-48-like foram confirmados por PCR convencional e os produtos foram purificados e sequenciados. A relação clonal dos isolados produtores de OXA-370 foi avaliada pela técnica de macrorrestrição do DNA seguido de PFGE e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram analisadas por E-test® e/ou microdiluição em caldo. Os plasmídeos foram extraídos por lise alcalina e inseridos em Escherichia coli TOP10 por eletroporação. Bibliotecas de DNA plasmidial foram preparadas utilizando-se o kit Nextera DNA e a seguir foram sequenciadas no sistema MiSeq. As sequências foram montadas utilizando-se o programa SeqMan NGen e os contigs foram alinhados utilizando-se o SeqMan Pro. A plataforma RAST foi utilizada para anotação automática das sequências e a curadoria manual foi realizada utilizando-se o programa ARTEMIS. As sequências completas dos plasmídeos foram comparadas as disponíveis no GenBank utilizando-se o BLAST. As sequências de nucleotídicas dos plasmídeos foram alinhadas utilizando-se o BioEdit. Resultados: Um total de 4.451 enterobactérias foram avaliadas, provenientes de 28 hospitais do Rio Grande do Sul no período de abril de 2013 a abril de 2015. O gene blaOXA-48-like foi detectado em 74 (2,5%) isolados não sensíveis a pelo menos um dos carbapenêmicos. Quanto à distribuição segundo a gênero e/ou espécie, o gene foi detectado em Enterobacter spp. (44,6% complexo E. cloacae e 2,7% E. aerogenes) e 7 Klebsiella spp. (31,1% K. pneumoniae e 6,7% K. oxytoca), seguido por Escherichia coli, (6,7%), Morganella morganii, (2,7%), Citrobacter freundii (1,3%), Proteus mirabilis (1,3%), Providencia stuartii (1,3 %) e Serratia spp. (1,3%). Estes isolados foram provenientes de cinco hospitais, sendo 67 (90,5%) do hospital onde o gene blaOXA-370 foi detectado pela primeira vez. O sequenciamento de blaOXA-48-like foi realizado em 52 isolados, incluindo E. cloacae, E. aerogenes, K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e C. freundii; todos apresentando 100% de identidade com blaOXA-370. A PFGE revelou a presença de clones distintos entre K. pneumoniae, E. cloacae, K. oxytoca e E. coli. As taxas de susceptibilidade ao meropenem, imipenem e ertapenem entre os isolados produtores de OXA-370 foram 92,3%, 78,8% e 7,7%, respectivamente; a CIM50/CIM90 foram 0,38/2 mg/L e 1/3 mg/L para meropenem e imipenem, respectivamente. Um total de seis plasmídeos tiveram suas sequências nucleotídicas completas determinadas. Todos eram circulares e o conteúdo de GC variou entre 46,7 e 47,2%. Os plasmídeos sequenciados pertencem ao grupo de incompatibilidade IncX e apresentam tamanho aproximado a 70kbp. Além de blaOXA-370 e genes de mobilização, os plasmídeos albergavam também blaCTX-M-8. A análise das sequências mostrou que blaOXA-370 está localizado em um transpóson composto, contendo quatro genes que codificam transposases, designado Tn6435. Conclusão: Em geral, a análise de susceptibilidade antimicrobiana sugere que a presença de OXA-370 não acarreta impacto significativo no perfil de sensibilidade aos carbapenêmicos meropenem e imipenem nos isolados de enterobactérias avaliados neste estudo. Além disso, foi possível observar que o gene blaOXA-370 está disseminado entre diversas espécies e clones de Enterobacteriaceae, indicando um alto potencial de disseminação. Por meio da análise da sequência de plasmídeos carreadores de blaOXA-370 foi possível identificar um novo elemento genético móvel, designado transpóson Tn6435, o qual está associado a disseminação de OXA-370 em isolados de enterobactérias no Rio Grande do Sul.