Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2019 |
| Autor(a) principal: |
Mazzeu, Bruna Fonseca |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://hdl.handle.net/11449/190943
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Resumo: |
A engenharia metabólica tem ajudado a melhorar ou redirecionar as vias metabólicas, fazendo modificações genéticas, como, a deleção ou superexpressão de genes e desta forma alterando a atividade de reações enzimáticas específicas. Friedelina é um triterpeno pentacíclico encontrado nas folhas das espécies de Celastraceae, que demonstrou inúmeras atividades biológicas e é precursor dos triterpenos quinonemetideos, promissor antitumoral. É biossintetizada a partir da ciclização do 2,3-oxidosqualeno e envolve o número máximo de rearranjos para a formação de uma cetona por desprotonação do intermediário hidroxilado sem o auxílio de uma enzima oxidoredutase. O estudo das enzimas responsáveis pela produção de metabólitos secundários é importante na busca de novas alternativas sustentáveis para a produção dos mesmos. Nessas condições, friedelina sintase de Maytenus ilicifolia foi clonada e expressa em Saccharomyces cerevisiae e Escherichia coli, levando a sua obtenção em um sistema heterólogo. A obtenção da fração enriquecida com friedelina sintase, foi realizada em duas etapas cromatográficas: cromatografia por afinidade, utilizando uma coluna com resina Ni–NTA (ácido nitrilotriacético) e cromatografia de troca iônica com resina de troca aniônica. A presença e pureza de MiFRS foi avaliada por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) revelado com Coomassie e comparado com o perfil em Western Blot. As etapas de purificação removeram uma grande parte das proteínas contaminantes. Os estudos de mutação sitio dirigida in vivo foram realizados com quatro mutações: a troca de um resíduo de cisteína, na posição 369 por um resíduo de prolina (C369P), a troca de uma fenilalanina, na posição 473 por um triptofano (F473W), a troca de um resíduo de metionina, na posição 549 por um resíduo de serina (M549S) e a troca de uma leucina por uma fenilalanina, na posição 552 (L552F). As mutações C369P e F473W levaram a perda de função, além de não produzir qualquer outro triterpeno. Os mutantes M549S e L552F conservaram a atividade da enzima, produzindo friedelina e foram capazes de produzir β-amirina e α-amirina. |
