Padronização da genotipagem da variante G202A da G6PD A-: análise comparativa da relação custo-benefício entre TETRA-ARMS e sequenciamento Sanger

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Takara, Alexandre Hideaki [UNESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: G6PD; genotipagem; Sequenciamento Sanger; TETRA-ARMS-PCR; genotyping; Sanger sequencing
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/165615

A deficiência da enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD) é uma anormalidade genética de alta prevalência populacional que resulta em uma menor reatividade do sistema de óxido-redução eritrocitário, geralmente sem repercussões clínicas; estima-se que mais de 300 milhões de pessoas são portadoras dessa alteração. A enzima é expressa em todos os tecidos e catalisa a primeira etapa da Via das Pentoses. Nas hemácias, essa via é de fundamental importância na manutenção do equilíbrio de seu estado redox e a deficiência dessa enzima pode favorecer eventos hemolíticos agudos e crônicos; e em recém nascidos, pode contribuir para o agravamento da icterícia neonatal. O diagnóstico da deficiência baseia-se na atividade enzimática, identificada através de testes quantitativos e qualitativos. Os testes qualitativos limitam-se a agrupar indivíduos em “deficientes” e “não deficientes”, já os métodos quantitativos são mais precisos na inferência dessa atividade. Estas técnicas podem necessitar de repetições dos testes para confirmação de resultados incongruentes. Por outro lado, a variante genética responsável pela deficiência pode ser precisamente reconhecida através de testes de diagnóstico molecular. O presente projeto tem como objetivo desenvolver uma metodologia de identificação molecular da variante G202A, frequentemente encontrada na população brasileira, e realizar uma comparação do custo-benefício com a metodologia de sequenciamento de Sanger. Ao todo, foram analisadas 107 amostras de sangue periférico coletado em papel filtro. Após a extração de DNA, foram realizados amplificação e sequenciamento do éxon 4 do gene G6PD, onde a mutação se encontra. A ferramenta on line “Primer1” foi utilizada para sintetizar os oligonucleotídeo alelo-específicos para a reação de genotipagem TETRA-ARMS. Foram identificados 22 indivíduos homozigotos para a variante deficiente, 84 indivíduos homozigotos para o alelo selvagem e 1 indivíduo heterozigoto, resultados conformados pelo sequenciamento direto das amostras. O custo por reação da TETRA-ARMS foi três vezes menor em comparação ao sequenciamento Sanger. Concluímos que TETRA-ARMS é um protocolo adequado para detecção da G202A em humanos.