Alterações no perfil de metilação do DNA e identificação de transcritos diferencialmente expressos em cana-de-açúcar em resposta ao SCMV (Sugarcane mosaic virus)

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Silva, Marcel Fernando da [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: epigenética; genes candidatos; infecção viral; perfil de expressão; Saccharum officinarum; epigenetics; candidate genes; viral infeccion; expression profile
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/152479

O mosaico da cana-de-açúcar é uma das principais viroses da cultura, sendo os estudos de padrões de metilação e de transcriptoma de contribuição para a compreensão da resistência genética à doença. O presente trabalho aplicou a técnica MSAP (“Methylation-sensitive amplified polymorphism”) em dois cultivares de cana-de-açúcar de resposta contrastante à doença do mosaico, causada pelo Potyvirus Sugarcane mosaic virus (SCMV), nas condições de inoculação falsa e inoculação com SCMV, para análise de alterações no padrão de metilação. As alterações no padrão de metilação causadas pela interação com o SCMV foram identificadas por meio de clonagem e sequenciamento. Fragmentos diferencialmente expressos (FDEs), previamente obtidos pela técnica cDNA-AFLP (“cDNA-amplified fragment length polymorphism”), também foram clonados e sequenciados para a identificação de genes candidatos associados à resistência ao SCMV. Em análises da frequência dos padrões de presença e ausência de bandas MSAP, níveis de metilação genômica variando de 33% a 35,4% foram observados para IAC91-1099, e de 33% a 37,3% para IACSP95-5000, com uma pequena proporção de loci alterados em resposta ao SCMV para ambos os cultivares. A análise global pelo pacote R MSAP indicou níveis de metilação genômica de 40%, além de demonstrar que as variações epigenéticas entre os cultivares (Phi_ST = 0,32; P = 0,008) apresentaram menor extensão que as variações genéticas (Phi_ST = 0,96; P = 0,0067). As análises AMOVA e PCoA confirmaram a pequena proporção de polimorfismos ocasionados pela infecção por SCMV, sendo as variações devidas a tempo de coleta mais proeminentes. Essas alterações, no entanto, foram específicas para os cultivares em estudo, sugerindo diferenças epigenéticas na resposta a inoculação com o SCMV. Enquanto o cultivar resistente IACSP95-5000 apresentou maiores polimorfismos de hipometilação 24 e 72 horas após a inoculação (hai) e a maior ocorrência de hipermetilação 48 hai, o cultivar suscetível IAC91-1099 apresentou uma troca entre a metilação da citosina interna e a semimetilação da citosina externa. O sequenciamento de polimorfismos MSAP decorrentes da interação com SCMV indicaram relevância para a caracterização da interação cana-de-açúcar e SCMV, uma vez que foram observados alinhamentos com transcritos com função putativa de resposta a estresses bióticos e abióticos, remodelação da cromatina e elementos transponíveis. Já os alinhamentos MSAP com região genômica revelaram possíveis regiões promotoras para os transcritos à jusante, relacionados à proteína kinase e elementos transponíveis. Os alinhamentos dos FDEs, oriundos do marcador molecular cDNA-AFLP, indicaram vias possivelmente relacionadas à fotossíntese, recuperação pós-estresse, proteínas transmembranas, resposta a estresses abióticos, elementos transponíveis e remodelação de cromatina via metilação de DNA e alterações na histona 3 (H3). A região promotora dos fragmentos MSAP e FDEs apresentou elementos reguladores responsivos a estresses, fitormônio e vias epigenéticas, além da ocorrência de ilhas CpG, sugerindo conexões entre alterações no transcriptoma e no perfil de metilação de DNA. A validação de três FDEs por qRT-PCR revelou uma complexidade na expressão e um comportamento diferente do observado por cDNA-AFLP. Ainda assim, o FDE_1 pode explicar alguns dos polimorfismos de hipometilação de DNA observados pelo marcador molecular MSAP, enquanto o FDE_2 pode explicar as diferenças na expressão de sintomas de mosaico entre os cultivares. Por sua vez, a regulação negativa do FDE_4 em IACSP95-5000 se assemelha ao observado na literatura para resistência genética em milho a um Potyvírus do subgrupo do SCMV.