Validação funcional de genes-alvo de microRNAs em carcinoma hepatocelular

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Campos, Carolina Fazio
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Carcinoma hepatocelular; microRNAs; miR-451a; Genes-alvo; Vias moleculares; Linhagens tumorais; Validação funcional; Hepatocellular carcinoma; Target genes; Molecular pathways; Tumor cell lines; Functional validation
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/193592

Introdução: miRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas que regulam a expressão gênica associada a diversos mecanismos biológicos. Os miRNAs têm sido indicados como potenciais biomarcadores para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular (CHC). CHC é a quarta causa mais comum de morte por câncer e é frequentemente associado com mau prognóstico, agressividade, resistente a medicamentos e diagnostico avançado. Objetivo: Identificar e validar experimentalmente a interação entre miRNA/genes-alvo relacionados com o processo de tumorigênese do CHC e contribuir para a identificação de vias moleculares relevantes para o desenvolvimento tumoral. Além disso, verificar o efeito da alteração da expressão do miRNA escolhido sobre o potencial de proliferação, migração e invasão celular nas linhagens de CHC. Material e Métodos: A seleção do miRNA foi feita a partir de dados anteriores do grupo e análises de bioinformática. A identificação dos genes-alvo foi realizada por meio de ferramentas de predição computacional (mirDIP e miRTarBase). As linhagens celulares de câncer de CHC (Hep 3B e PCL/PRF/5) foram transfectadas com o mimético do miRNA selecionado, ou o seu controle negativo, a fim de avaliarmos a expressão dos genes-alvo (RT-qPCR). Após a transfecção, foi avaliado o potencial de proliferação celular (MTS), migração (wound healing) e invasão (ensaio transwell) das linhagens. Ensaio da Luciferase foi utilizado para confirmar a ligação do miRNA ao gene-alvo. Resultados: O miR-451a foi selecionado para a validação funcional por apresentar consistentemente diminuição de expressão em CHC de três bancos de dados (tumores primários de pacientes, meta-análise e TCGA). Análise in silico revelou 12 possíveis genes candidatos regulados pelo miR-451a relevantes na tumorigênese e ainda não validados experimentalmente: FMNL3, BUB1B, SPC25, KIF2A, PLEKHG2, BAK1, HMGB2, MEF2D, CDKN2B, HELLS, RRAGD, CSE1L. Nas duas linhagens celulares, o aumento da expressão do miR-451a após transfecção com miRNA mimético resultou na diminuição significativa (p<0,05) da expressão do gene SPC25. O ensaio de luciferase demonstrou a ligação do microRNA ao gene SPC2, confirmando que os gene SPC25 é alvo direto do miR-451a. Além disso, a restauração da expressão do miR-451a levou à diminuição de proliferação, migração e invasão nas linhagens celulares Hep 3B e PCL/PRF/5. Conclusão: O gene SPC25 foi identificado como um novo alvo do miR-451a e associado a CHC. Além disso, nossos achados indicam que o miR-451a está relacionado à tumorigênese e progressão do CHC, sendo sugerido como um potencial alvo para a terapia do CHC.