Padronização do cultivo in vitro de hemócitos de abelha Apis mellifera africanizada

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Deboni, Nicole Pavan Butolo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Sistema imune; Hemolinfa; Contagem total de hemócitos; Cultura primária de hemócitos; Immune system; Hemolymph; Total hemocyte count; Primary culture of hemocytes
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/191989

Apesar da importância das abelhas como polinizadores, o declínio de suas populações tem sido alarmante e, constantemente, associado ao contato desses insetos com agrotóxicos. No caso de intoxicação, um dos primeiros sistemas afetados é o sistema imune, já que ele constitui a primeira barreira de defesa e manutenção do organismo. Contudo, avaliações dos impactos causados por agentes externos nesse sistema ainda são escassas e mensuradas de maneira indireta. Assim, buscando testes mais específicos a nível celular, o presente trabalho propôs a padronização do cultivo in vitro de hemócitos de abelha Apis mellifera africanizada, para posteriores estudos ecotoxicológicos. Tal padronização demandou o estabelecimento de diversos parâmetros, dentre eles a quantidade de células para o início do cultivo, a melhor temperatura e o estágio de desenvolvimento para coleta da hemolinfa, o método adequado para extração de hemolinfa, a determinação do meio de cultura ideal, das condições laboratoriais, etc. Primeiramente observou-se que as larvas de abelha A. mellifera africanizada em quinto instar possuíam uma quantidade significativamente maior de hemócitos circulantes (p<0,001) do que os outros estágios avaliados (recém emergidas e forrageiras), sendo assim, foi estabelecida a coleta da hemolinfa de larvas cultivadas in vitro, a fim de minimizar as chances de contaminações da cultura celular. Além disso, a temperatura também se mostrou um fator importante na variação da quantidade de hemócitos, estabelecendo-se a faixa de 32±2 oC como ideal para a coleta. Diversas técnicas de extração de hemolinfa das larvas também foram testadas. A técnica de extração, a partir de uma pequena incisão na região da cabeça da larva com o auxílio de uma tesoura oftalmológica, foi padronizada. A qualidade da amostra foi estabelecida por meio da leitura em turbidímetro, obtendo-se um valor de referência (22.432,35 - 24.504,87) dado em unidades nefelométricas de turbidez (NTUs) para as amostras de hemolinfa. Após as padronizações iniciais estabeleceu-se o cultivo dos hemócitos de larvas de abelha A. mellifera africanizada em quinto instar criadas in vitro, em que o meio de cultura Grace’s demonstrou o melhor desempenho para manutenção e proliferação celular, havendo uma média de 669 mil células após 24 horas de incubação e 1.141mil após 96 horas de incubação. As fotomicrografias em microscópio invertido com contraste de fase também permitiram observar a proliferação celular no meio Grace’s. A caracterização celular foi obtida por análise morfológica, através de uma característica dos hemócitos em que as células tornam-se alongadas devido ao reconhecimento de um agente estranho (placa de cultura); após as medições, essas células foram comparadas com outras encontradas em demais trabalhos com hemócitos de abelha no mesmo estágio de desenvolvimento, permitindo inferir que as células cultivadas eram hemócitos de larvas de abelha A. mellifera africanizada.