Da produção da proteína verde fluorescente à sua extração utilizando sistemas aquosos bifáficos

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Lopes, Camila
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: proteína verde fluorescente; biomarcador; produção; extração; sistemas micelares de duas fases aquosas; green fluorescent protein; biomarker; production; extraction; aqueous micellar two-phase systems
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/153390

A proteína verde fluorescente (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) é um biomarcador utilizado na produção de proteínas de fusão, amplamente empregado in vivo e in vitro. Este trabalho avaliou a produção da GFP expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] em mesa incubadora rotativa e biorreator, e sua posterior extração utilizando Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Na etapa de produção em mesa incubadora rotativa, estudou-se a influência da taxa de agitação, tempo de indução e concentração do composto indutor, isopropil-β-1-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), sobre a produção da GFP, e apenas a variação da taxa de agitação e o tempo de indução alteraram a produção de GFP. A melhor produção de GFP (314,59 mg/L) foi obtida a 30°C após 22 h de cultivo a uma agitação de 150 rpm, induzindo com 0,5 mM de IPTG realizada 10 h após o início do cultivo (meio da fase exponencial de crescimento). Posteriormente, avaliou-se menores concentrações de IPTG (0,25; 0,125 mM) na produção de GFP e observou-se que os níveis de produção foram mantidos. Estes estudos iniciais, foram a base para as condições empregadas em biorreator tanque agitado, que operou no modo batelada a uma agitação de 200 rpm, aeração de 2 vvm (volume de ar/ volume de meio) e indução com 0,125 mM de IPTG após 6 h de cultivo. Nas condições citadas, obteve-se apenas uma produção de 128,13 mg/L de GFP, desse modo, apesar da potencialidade da ampliação de escala na produção desta biomolécula, estudos posteriores são ainda necessários. Após os estudos de produção, realizou-se o rompimento das células bacterianas por ciclos continuados de congelamento/ descongelamento. A GFP do lisado celular foi então submetida a estudos de sua estabilidade perante diferentes pHs (3 - 12) e temperaturas (25º, 37º e 50ºC), mostrando-se estável entre os pHs 7 a 11 e em temperaturas de 25°C e 37°C, mas não estável a uma temperatura de 50°C. Nos estudos de extração foram utilizados os SMDFA compostos por tampão McIlvaine pH 7, Triton X-114, e o líquido iônico [P6,6,6,14]Cl como adjuvante. O melhor coeficiente de partição (K = 30,91) foi obtido no sistema formado por 2,5 % (m/m) de Triton X-114; 0,5% (m/m) de [P6,6,6,14]Cl. Os resultados obtidos demonstraram que uma escolha apropriada das melhores condições de cultivo permitem um aumento da produção de GFP utilizando a cepa de E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)]. Além disso, os estudos com SMDFA mostraram alta influência dos seus componentes na partição da GFP, demonstrando a potencialidade de sistemas aquosos na purificação da GFP.