Diferentes estratégias de cultivo de Escherichia coli recombinante para produção de proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein - GFP)

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Jesuino, Aylime Castanho Bolognesi Melchior
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: GFP; Escherichia coli; modo de operação batelada alimentada; proteína verde fluorescente; condições de cultivo; aumento de escala; green fluorescente protein; fed batch
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/191825

A proteína verde fluorescente (GFP; green fluorescent protein) tem sido amplamente empregada como biomarcador e pode ser obtida a partir da manipulação gênica, utilizando Escherichia coli recombinante como microrganismo para expressão proteica. A utilização de agentes indutores de expressão proteica se faz necessária para a obtenção da GFP, entretanto o IPTG (isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo), análogo da lactose normalmente utilizado, apresenta alta toxicidade e custo, necessitando-se encontrar uma alternativa a seu uso. Sendo assim, o presente trabalho visou a melhora do processo de obtenção da proteína heteróloga GFP utilizando-se E. coli recombinante em modo de operação batelada alimentada em biorreator convencional do tipo tanque agitado e aerado, adicionando-se lactose ao meio de cultivo para agir como fonte de carbono e agente indutor. Foram realizados ensaios a fim de avaliar o rendimento na formação de biomassa e proteína GFP frente a utilização de glicose, lactose e IPTG, mostrando-se a lactose como a mais promissora. Em ensaio em biorreator convencional do tipo tanque agitado e aerado, utilizando-se lactose na concentração de 5 g/L ou IPTG 0,05 mM foi observada expressão de GFP de 164 mg/L e 105 mg/L, respectivamente. Posteriormente foram realizados ensaios para testar diferentes meios, meio baseado no meio de autoindução e meio HCD, entretanto nenhum apresentou resultado satisfatório na formação de biomassa e produção de GFP que justificasse sua utilização no lugar do meio LB suplementado com lactose. Em planejamento experimental realizado variando-se temperatura, velocidade de agitação, preenchimento do frasco Erlenmeyer e concentração do indutor, podendo ser esse lactose ou IPTG, foi observada influência estatisticamente significativa num nível de significância de 0,01 do preenchimento do frasco e concentração de lactose na formação de biomassa de forma diretamente proporcional, enquanto que para a produção de GFP a temperatura foi a única variável significativa, de forma inversamente proporcional, levando a uma produção de 476 mg/L de GFP na melhor condição (40 g/L de lactose, 15% e preenchimento, 250 rpm e 20℃). Após determinadas as melhores condições, foram realizados ensaios em biorreator no modo de operação batelada variando-se a aeração (0,5 vvm e 0,75 vvm), velocidade de agitação (400 rpm, 600 rpm, 800 rpm e 1000 rpm) e temperatura (20℃ e 25℃). Foi observado que a melhor temperatura para realização dos ensaios foi a 25℃ e que a aeração não se mostrou interferente na produção de biomassa e GFP, entretanto, o aumento da velocidade de agitação trouxe ganho expressivo na expressão proteica, mostrando-se as velocidades de 800 rpm e 1000 rpm as condições mais promissoras (487,37 mg/L de GFP e 529,70 mg/L de GFP, respectivamente). Com adição de extrato de levedura e sulfato de magnésio ao meio, em ensaio realizado em frasco agitado, foi obtida produção de GFP de 1,1 g. Realizando-se ensaio em biorreator em modo de operação batelada alimentada com alimentação iniciada com 30 h e 48 h de cultivo, foi obtido melhor resultado com início no menor tempo, levando a expressão de 842,71 mg/L de GFP. Por fim, foi realizado teste com enriquecimento com oxigênio puro, a fim de garantir a completa oxidação do grupamento cromóforo, que levou a aumento de aproximadamente 2,15 vezes.