Estudos da enantio- e estéreo-especificidade da SADH de Thermoanaerobacter ethanolicus 39E: mutagênese, expressão, purificação, cristalização e estudos cristalográficos

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2003
Autor(a) principal: Watanabe, Leandra [UNESP]
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/100486
Resumo: A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos