Reprogramação do metabolismo de purina na bactéria Bacillus subtilis por tecnologia de pequenos RNAs não codificadores (sRNAs)

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Lins, Milca Rachel da Costa Ribeiro
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Bacillus subtilis; Purinas; Riboflavina; Riborregulação; RNAs reguladores; RNAs sintéticos; Riboswitch; Purines; Regulatory RNAs; Riboflavin; Riboregulation; Synthetic RNAs
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/183260

As técnicas mais usadas atualmente para alterar o fluxo metabólico por uma determinada via são a deleção e/ou inserção de sequências regulatórias ou genes no cromossomo bacteriano. Estes são métodos que alteram permanentemente a via metabólica em questão, perturbando o balanço metabólico durante a fase lag de crescimento, o que muitas vezes leva a um excessivo prolongamento desta fase além de diminuir a viabilidade celular. O metabolismo de purinas em Bacillus subtilis tem grande potencial para manipulação genética e produz metabólitos com valor biotecnológico. Cinco riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE e pbuG) controlam o metabolismo de purina em B. subtilis promovendo a terminação precoce da transcrição em ligação com guanina ou adenina. O GTP gerado nesta via é utilizado na biossíntese da vitamina B2 (riboflavina), apresentando o mesmo mecanismo de regulação com riboswitch de flavina-monofosfato (ribDG). Neste estudo, um novo modelo de controle de metabolismo de purina foi construído visando o aumento reversível do fluxo de carbono pela via em B. subtilis utilizando pequenos RNAs não-codificadores sintéticos (sRNAs). Estes foram desenhados e sintetizados para interferir na regulação da expressão gênica realizada pelos riboswitches, mantendo assim a via biossintética ativa. Os riboswitches foram caracterizados por uma nova metodologia in vitro na presença dos ligantes guanina, adenina ou FMN, e nas células de B. subtilis, sendo possível constatar o papel regulador sobre o operon da bioluminescência luxABCDE. Os sRNAs sintéticos foram desenhados no software Ribomaker para interferir na estrutura secundária dos riboswitches e, após simulações in silico da interação intermolecular riboswitch-sRNA, a funcionalidade dos sRNAs também foi ensaiada in vitro. B. subtilis reprogramado com os sRNAs desenhados contra os riboswitches purE, pbuE e ridDG foram capazes de neutralizar o efeito riborregulador comparado aos controles, após análises de bioluminescência e fluorescência em leitor de microplacas. A inserção da sequência RiboJ à extremidade 5’ UTR do sRNA(purE) proporcionou ótimas características a B. subtilis para ser utilizada como uma linhagem industrial, por exemplo, fase lag diminuída e crescimento populacional maior. Foi possível modelar exemplarmente o bem estudado metabolismo de purinas nesta bactéria amplamente utilizada pela indústria biotecnológica, e demonstrar que a tecnologia sRNA é realmente adequada para a engenharia metabólica de cepas microbianas produtoras de produtos biotecnológicos. A vantagem deste conceito inovador de controle é que a expressão do gene pode ser tanto ligada como desligada conforme necessário. O novo conceito é amplamente aplicável e pode ser um elemento inovador no portfólio da moderna biologia sintética.