Isolamento e caracterização dos genes que codificam malato sintase e o repressor Nrg1 em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Medina, Pilar Ximena Lizarazo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso embargado
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse; Doutorado em Microbiologia Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Repressão catabólica; Malato sintase; Crinipellis perniciosa; Catabolic repressor; Malate sintase; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1565

Os genes que codificam o repressor catabólico Nrg1 e a enzima malato sintase de Crinipellis perniciosa foram clonados e caracterizados. A região codificadora do gene nrg1 possui 2121 pb e é interrompida por um íntron de 60 pb posicionado a partir da análise da seqüência de cDNA. Análises por hibridização do DNA total mostraram que o gene está presente em cópia única no genoma do fungo. A proteína deduzida apresenta dois dedos de zinco característicos de proteínas Nrg e possui 256 aminoácidos. A região 5 terminal foi seqüenciada e um potencial cis-elemento para a ligação da proteína reguladora PACC foi identificado. Foram também detectados os cis-elementos TATA box e CAAT box. A regulação da transcrição foi avaliada pela técnica de RT-PCR. O gene foi diferencialmente regulado de acordo com a concentração de glicose. A transcrição de nrg1 foi 2,1 vezes maior no micélio crescido em meio contendo glicose 0,1% do que no meio com glicose 3,0%. Em outra fonte de carbono como glicerol a transcrição foi 4,6 vezes maior do que à reportada em glicose 3,0%. A avaliação da transcrição em relação ao pH indicou uma maior transcrição em pH baixo (pH 2 e 3) do que em pH 4, 6,8 e 8. Esses resultados podem ser explicados pela presença de sítios para a proteína reguladora PacC, que é responsável pela regulação em resposta ao pH. Este é o primeiro relato da presença da proteína repressora Nrg1 em fungos filamentosos. O segundo gene estudado neste trabalho codifica a enzima malato sintase em C. perniciosa. O gene possui 1888 pb e é interrompido por cinco íntrons. Uma proteína de 539 resíduos de aminoácidos foi obtida da tradução deste gene e apresenta a seqüência característica [KR]-[DENQ]-HX(2)-G-L-N-X-W-D-Y-[LIVM]-F. Na região 5 terminal do gene malato sintase foi localizado um possível TATA box e dois possíveis sítios CAAT. A hibridização do DNA de isolados de C. perniciosa dos grupos C1, C2, C3 e C9, com o gene malato sintase, mostrou que este está presente em cópia única no genoma. Interessantemente, esta hibridização permitiu separar os isolados em dois grupos. Nos isolados C1 e C3, que foram coletados na Bahia e no Amazonas, o fragmento hibridizado possui aproximadamente 5.0 kb, mas nos isolados C2 e C9, que foram provenientes da Bahia e do Pará, corresponde a um fragmento de 4,5 kb. A transcrição do gene malato sintase foi analisada pela técnica RTPCR. A transcrição do gene foi analisada após o crescimento do micélio durante 8 dias a 27 ºC, depois este foi lavado e transferido para meio mínimo contendo acetato, isocitrato, glioxilato na presença e ausência de glicose, onde permaneceu 12 ou 24 horas. Foi observada ausência de repressão catabólica. Neste estudo também foi evidenciada a transcrição do gene malato sintase em glicerol e em extrato de polpa de cacau. O isolamento e caracterização dos genes que codificam a malato sintase e a proteína reguladora Nrg1 em C. perniciosa, junto com a disponibilidade de um sistema de transformação, permitiram a obtenção de mutantes para evidenciar os papeis das proteínas na patogenicidade.