Domínios funcionais em Cel9B de Thermobifida fusca e prospecção de celulases bacterianas

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Filho, José Carlos de Oliveira
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; Microbiologia Agrícola
• Palavras-chave em Português: Celulases; Actinomicetos; Modulos de Ligação à Celulose; Thermobifida fusca; Microbiologia Aplicada
• Link de acesso: https://locus.ufv.br//handle/123456789/32390

Thermobifida fusca Cel9B, também denominada de E1, é uma endoglucanase muito ativa sobre carboxi-metil celulose. É composta pelo domínio catalítico (CD) da família 9 ligado a um domínio de ligação a carboidrato da família 4 (CBM4), seguido por um domínio tipo imunoglobulina na extremidade amina e um domínio de ligação a carboidrato da família 2 (CBD2), ligado ao CD por um linker na extremidade carboxílica da proteína. Para estudar o papel do domínio catalítico e dos dois domínios de ligação a carboidratos presentes nessa enzima, foram construídas três formas variantes, clonadas e expressas em Escherichia coli. As massas moleculares de E1 e suas formas variantes foram determinadas por espectrometria de massa, e os valores obtidos foram correspondentes àqueles preditos in silico a partir da sequência de DNA. A enzima tipo selvagem e suas formas variantes foram purificadas e ensaios enzimáticos e de ligação foram realizados sobre vários substratos. O domínio catalítico mostrou as maiores atividades sobre os substratos celulósicos, porém a presença de CBD2 melhorou seu desempenho enzimático sobre celulose microcristalina e celulose amorfa tratada com ácido fosfórico, substratos nos quais detectou-se ligação de CBD2. Adicionalmente, a presença desse domínio auxiliou na degradação de xiloglucana. CBD2 apresentou ligação a α-quitina, porém E1 não possui atividade sobre esse polímero. CBM4 interferiu negativamente na degradação dos substratos celulósicos e também xiloglucana porque sua presença diminuiu a atividade enzimática nesses casos. Por outro lado, a presença de CBM4 melhorou o desempenho enzimático do CD de Cel9B sobre xilana, porém sua ligação a esse substrato não foi detectada. O alinhamento de membros da família de CBM4 de Cellulomonas fimi, Thermotoga maritima e T. fusca mostrou que resíduos de aminoácidos aromáticos envolvidos na ligação ao substrato estão presentes em posições conservadas em E1 e o modelo gerado para sua estrutura mostrou região potencial para ligação de substrato. Neste trabalho foi obtido também um banco de bactérias celulolíticas provenientes do solo da mata do Belvedere, crescimento secundário de mata Atlântica, e do solo de mata de eucalipto, plantada na mesma região. O meio ágar arginina glicerol foi o mais eficaz para o isolamento de bactérias celulolíticas a partir do solo de mata do Belvedere ou mata de eucalipto, porém o meio ágar extrato de solo demonstrou um maior potencial para isolamento de microrganismos diversos, uma vez que proporcionou o crescimento exacerbado de fungos, não presentes nas mesmas condições nos outros meios. Os isolados mostraram diversidade de características macro e microscópicas, sendo em sua maioria organismos Gram positivos, e das 317 bactérias isoladas, 57 foram detectadas como produtoras de celulases pelo teste de celulose azure. O isolado 103 possui o conjunto de celulases mais ativas contra esse substrato, nas condições testadas. Este isolado é o candidato para continuação dos estudos nesta linha de pesquisa no laboratório de Microbiologia Industrial da Universidade Federal de Viçosa. A diversidade de enzimas celulolíticas obtidas pode propiciar o uso de seus determinantes genéticos em evolução direcionada às características requeridas para processos industriais de bioconversão de resíduos celulósicos.