Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da proteína recombinante GmSBP2/S64 da soja (Glycine max)

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Luz, Dirce Ferreira
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Doutorado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Proteína recombinante; Dicroísmo circular; Fluorescência; Recombinant protein; Circular dichroism; Fluorescence; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/333

A proteína de ligação à sacarose (SBP) pertence à família das proteínas cupim e é relacionada estruturalmente às proteínas de armazenamento do tipo vicilinas. Nesta investigação, a SBP foi expressa em E. coli e grandes quantidades da proteína foi acumulada na fração insolúvel como agregados, proteína desnaturada. A renaturação da proteína purificada se deu com a remoção progressiva da uréia no tampão de renaturação, que continha um sistema de retirada de óxido (2 mM de glutationa reduzida e 0,2 mM de glutationa oxidada) e glicerol 5% (v/v) como um agente estabilizador de proteína. A renaturação da proteína foi monitorada usando o dicroísmo circular na faixa do UV distante (CD), a fluorescência intrínseca, e o apagamento por acrilamida, KCl e KI. A porcentagem da estrutura secundária da proteína renaturada, que foi calculada com base no espectro de CD, foi consistente com aquela obtida pelo modelamento teórico com grande predominância da estrutura de beta barril (42%) sobre a alfa-hélice (9,9%). O máximo da emissão de fluorescência de 303 nm para a SBP indicou que o triptofano fluorescente foi completamente internalizado dentro de um ambiente altamente hidrofóbico. Não obstante, o apagamento do triptofano pela acrilamida, KI e CsCL e respectiva constante de Stern-Volmer (Ksv) de 23,5 +- 0,5 M-1, 16,1 +- 0,2 M-1 e 4,9 +- 0,1 M-1 indicam que os resíduos de triptofano fluorescentes foram bastante acessíveis aos apagadores e, conseqüentemente, expostos ao solvente. Foi medida também a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) da ligação da sacarose por titulação da fluorescência usando a proteína renaturada. A baixa afinidade de ligação da sacarose (Kd = 2,79 +- 0,22 mM) à proteína renaturada foi similar àquela da proteína nativa purificada das sementes de soja. Coletivamente, os resultados apontam que a estrutura enovelada da proteína renaturada é similar à proteína SBP nativa. Como um membro da família das proteínas bicupim que incluem proteínas de armazenamento de semente altamente estáveis, foi de interesse determinar a estabilidade estrutural da SBP. As desnaturações térmicas e químicas da proteína foram examinadas por monitoramento das mudanças nos espectros de CD e na fluorescência intrínseca da proteína renaturada. Os resultados indicam que a SBP permaneceu enovelada em uma extensão similar na presença ou ausência de 8 M de uréia ou de 6 M de GdnHCl. Do mesmo modo, foi razoavelmente estável em altas temperaturas. A alta estabilidade da proteína renaturada pode ser uma propriedade remanescente da SBP de seu parentesco evolucionário com as proteínas de armazenamento de sementes.