Testes complementares em sêmen e avaliação da síntese diferencial de proteínas e peptídeos aniônicos em plasma seminal de touros da raça Nelore classificados em aptos e inaptos à reprodução

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Martins, Leonardo Franco
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Biotecnologia, diagnóstico e controle de doenças; Epidemiologia e controle de qualidade de prod. de; Doutorado em Medicina Veterinária; UFV
• Palavras-chave em Português: Sêmen; Touro; Proteônica; Semen; Bull; Proteomic; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA::REPRODUCAO ANIMAL
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1435

As principais análises realizadas como rotina para avaliar a qualidade seminal são a motilidade espermática progressiva retilínea e morfologia para a mensuração da fertilidade de touros. Diversas técnicas complementares são utilizadas para melhorar avaliação da fertilidade de touros. Cada técnica está relacionada com diferentes aspectos da qualidade seminal e seus resultados ainda não são totalmente compreendidos. Foram realizados quatro experimentos. O experimento 1 teve como objetivo estudar as relações entre os aspectos físicos e morfológicos do sêmen com o teste hiposmótico em sêmen in natura de touros jovens e adultos. Foram utilizados 626 touros da raça Nelore, sendo 420 touros jovens e 206 touros adultos. Os touros jovens com idades variando de 18 a 22 meses e touros adultos com idades variando de 3 a 10 anos, foram submetidos a exame andrológico. Após a palpação das glândulas vesiculares e mensurações testiculares foi realizada a coleta de sêmen pelo método de eletroejaculação. Após a análise física e morfológica do sêmen foi realizado o teste hiposmótico. Após a classificação andrológica, 83% dos touros jovens e 94% dos touros adultos foram classificados em aptos à reprodução. Não houve diferenças entre as médias de perímetro escrotal dos touros classificados como aptos e inaptos à reprodução (P>0,05). Houve diferenças entre as médias de todos os aspectos físicos e morfológicos do ejaculado de touros inaptos e aptos à reprodução (P<0,05), mas não foram observadas no percentual de espermatozóides reativos ao teste hiposmótico (P>0,05). Com estes resultados, pode-se concluir que o teste hiposmótico não pode ser utilizado isoladamente para predizer o potencial reprodutivo de touros jovens e adultos da raça Nelore, pois não houve diferenças entre os percentuais de espermatozóides reativos do sêmen de touros aptos e inaptos à reprodução, e não houve relações com os principais aspectos de qualidade seminal. O experimento 2 teve como objetivo identificar proteínas diferencialmente sintetizadas em plasma seminal de touros jovens e adultos da raça Nelore classificados em aptos e inaptos à reprodução. Após o exame andrológico, os touros jovens foram classificados em aptos (117) e inaptos (49) à reprodução, e os touros adultos (56), em aptos à reprodução. As amostras de plasma seminal, conservadas em palhetas finas sob -196ºC, foram descongeladas à temperatura ambiente para serem realizadas as análises proteômicas. Foi realizada a MDLC offline, sendo a primeira dimensão a cromatografia de troca catiônica e a segunda a de fase reversa. Foram coletadas seis frações eluídas nas condições de equilíbrio (pH 7,0) na cromatografia de troca catiônica, que correspondem às frações de peptídeos e proteínas com caráter aniônico e neutro. As frações correspondentes aos picos eluídos obtidos na cromatografia de fase reversa foram analisadas em um espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF/TOF para a determinação da massa molecular das proteínas. Foram selecionados e analisados 96 eluatos coletados na cromatografia de fase reversa para a espectrometria de massa, com síntese protéica diferencial entre os tratamentos. Dezoito massas moleculares foram identificadas por espectrometria de massa, entre 4.233 e 13.560 Da. A proteína de 12.910 Da, com massa molecular e características semelhantes à aSFP (acidic seminal fluid protein), foi obtida em maior concentração nos touros aptos adultos, seguidos pelos aptos jovens e inaptos. Os perfis cromatográficos protéicos foram diferentes entre os grupos, sugerindo que a proteínas aniônicas podem ser estudadas visando identificar marcadores protéicos para a aptidão reprodutiva de touros da raça Nelore, pela análise proteômica do plasma seminal. Nos experimentos 3 e 4 foram estudadas as relações do teste hiposmótico com os aspectos físicos e morfológicos do sêmen, e testes complementares em sêmen in natura e congelado/descongelado de touros adultos da raça Nelore. No sêmen in natura foi feita a avaliação física e morfológica, a coloração supravital e o teste hiposmótico. Nas amostras congeladas/descongeladas, foram realizados os testes hiposmótico, coloração supravital, teste de termoresistência lento e a coloração fluorescente. No experimento 3 foram utilizados trinta ejaculados de seis touros adultos da raça Nelore. Foram utilizadas soluções com osmolaridades de 60, 100, 150 mOsm/kg e água destilada (19 mOsm/kg) com 15, 30 e 60 minutos de período de incubação a 37 ºC no teste hiposmótico. Apenas a água destilada apresentou diferença em relação aos valores médios obtidos no teste hiposmótico realizado no sêmen in natura (P<0,05). Não houve diferença entre os valores médios de espermatozóides reativos incubados com diferentes tempos de incubação, tanto no sêmen in natura como no congelado/descongelado (P>0,05). No experimento 4, foram utilizados 15 ejaculados de 3 touros adultos da raça Nelore. Foram utilizados 10, 20, 50 e 100&#956;L de sêmen em 1mL de solução hiposmótica. Não houve diferença entre os valores médios de espermatozóides reativos nas diferentes concentrações de sêmen no teste hiposmótico (P>0,05). Nenhum teste de integridade de membrana plasmática dos espermatozóides foi capaz de classificar os touros quanto à sua congelabilidade do sêmen nos experimentos 3 e 4. O teste hiposmótico correlacionou-se com as principais características de qualidade seminal e com os valores obtidos nos testes complementares (P<0,05). No experimento 3, concluímos que o teste hiposmótico pode ser realizado com 15 minutos de período de incubação e uma solução hiposmótica entre 60 e 150 mOsm/kg, tanto em sêmen in natura como em congelado/descongelado. De acordo com os resultados do experimento 4, o teste hiposmótico pode ser realizado com 20 a 100&#956;L em sêmen in natura, e 10 a 100 &#956;L de sêmen congelado/descongelado em 1mL de solução hiposmótica, sem interferir em seus resultados, mas preferencialmente deve-se optar por 100&#956;L, tanto para sêmen in natura como congelado/ descongelado, porque melhora a leitura das lâminas. De acordo com os resultados deste trabalho o teste hipósmótico não pode ser utilizado para predizer o potencial reprodutivo de touros da raça Nelore. Mas, o teste hiposmótico avalia outro aspecto da membrana plasmática dos espermatozóides e possue relações com os principais aspectos da qualidade seminal e outros testes complementares, por isso deve ser empregado para uma melhor compreensão dos seus resultados. A análise proteômica do plasma seminal em associação à avaliação andrológica pode ser uma ferramenta promissora para predizer a aptidão reprodutiva em touros, por meio da identificação de moléculas protéicas no plasma seminal.