Expressão dos genes sintéticos prM e E do vírus dengue-3 em Pichia pastoris: avaliação do uso em diagnóstico da dengue e análise do potencial imunogênico das proteínas

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Teixeira, Michelle Dias de Oliveira
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos; Doutorado em Biologia Celular e Estrutural; UFV
• Palavras-chave em Português: Dengue - Vacina; Diagnóstico; Pichia pastoris; Dengue - Vascina; diagnosis; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::ZOOTECNIA::NUTRICAO E ALIMENTACAO ANIMAL::AVALIACAO DE ALIMENTOS PARA ANIMAIS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/276

A dengue é a principal arbovirose que acomete humanos da atualidade. Com o número de casos cada vez maior é essencial a produção em larga escala de antígenos para o desenvolvimento de kits de diagnóstico rápidos para a detecção de pacientes infectados pelos vírus e a consequente intervenção médica adequada para os mesmos. Além disso, não há vacina eficaz disponível contra esta moléstia que acomete grande parte da população mundial. Assim, neste trabalho nós expressamos as proteínas prM e E do vírus dengue-3 em leveduras Pichia pastoris KM71H. As proteínas foram produzidas de forma solúvel no sobrenadante da cultura sob a forma de vírus- like particles (VLPs). O sobrenadante da cultura de leveduras foi submetido à purificação de proteínas através de cromatografia de afinidade usando uma coluna de níquel, porém sem êxito. Assim, o mesmo foi submetido a precipitações com concentrações de saturação crescentes de sulfato de amônio. Após confirmação por Western Blot, a fração de 20% de sulfato de amônio foi utilizada como antígeno em teste de ELISA indireto utilizando soros de pacientes, fornecendo sensibilidade de 73,91% e especificidade de 82,61%. Já a fração proveniente da precipitação com 80% mostrou-se mais satisfatória, fornecendo um teste com 82,61% de sensibilidade e 89,25% de especificidade para a detecção de anticorpos IgM específicos. Ainda, a fração e 80% foi utilizada para a pesquisa de anticorpos IgG específicos contra o vírus, fornecendo 76,09% de sensibilidade e 84,78% de especificidade. As frações de 20% e 80% foram avaliadas também quanto à sua capacidade de gerar respostas imunes contra o vírus dengue-3 em camundongos. Foi observada uma indução de resposta imune Th2, verificado pelo aumento da produção de IL-4 e IL-10 quando as células dos baços dos animais previamente imunizados foram estimuladas com o vírus dengue-3. Também foi induzida a produção anticorpos específicos nestes animais, mostrado através de imunofluorescência indireta utilizando-se os soros dos camundongos imunizados. Além disso, foi determinada a capacidade neutralizante de tais anticorpos, com um título de 512 de anticorpos neutralizantes. Também foi detectado nos animais imunizados com as proteínas recombinantes um aumento na população de células TCD4 ativadas e TCD4 de memória central. Dessa forma, a metodologia aqui proposta mostrou-se promissora para a obtenção de antígenos dos vírus dengue na busca por um candidato vacinal eficaz e criação de testes diagnósticos rápidos e baratos, o que é de grande valia uma vez que grande parte das áreas atingidas pela dengue são economicamente negligenciadas.