Avaliação de fatores associados à regeneração in vitro e transformação genético de cinco cultivares de mandioca

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Vaez, Juliana Rocha
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Doutorado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Manihot esculenta; Cultura de tecidos; Tissue culture; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/286

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma das culturas fundamentais para a alimentação humana, visto que é a quarta fonte mais importante de carboidratos nos trópicos. Devido à importância que a cultura atingiu nos últimos anos, o interesse no melhoramento e desenvolvimento de novas cultivares vem crescendo. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar fatores associados à regeneração in vitro e transformação genética de cinco cultivares de mandioca. Para tanto, explantes de mandioca de diferentes cultivares tiveram sua resposta embriogênica a dois reguladores de crescimento, picloram e 2,4 - D, avaliada em diversas concentrações. O regulador de crescimento 2,4 - D foi o que apresentou maior freqüência embriogênica, e as suas concentrações mais indicadas para as cultivares Mantiqueira, Parazinho, Vassourinha e Urubu foram, respectivamente, 2, 1, 2 e 2 mg/L. A embriogênese somática é um processo pelo qual células haplóides se desenvolvem através de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta. Embriões em estádio cotiledonar podem ter seu alongamento induzido por diversas combinações de reguladores de crescimento. Com o intuito de avaliar o meio que promoveria maior freqüência de alongamento, foram testadas as seguintes combinações: 0,4 mg/L de BAP, 0,25 mg/L de BAP + 0,25 mg/L AIB, 0,4 mg/L de GA3 e 0,25 mg/L de GA3 + 0,25 mg/L AIB. Entre os meios avaliados, o mais adequado foi o que continha 0,4 mg/L de GA3. Para induzir organogênese, faz-se uso de combinações entre reguladores de crescimento. As combinações hormonais de 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L AIB e 1,6 mg/L BA + 1,6 mg/L AIB foram avaliadas e a maior freqüência organogênica, obtida com o uso da primeira combinação citada. O processo de organogênese pode ser influenciado por vários fatores, por exemplo genótipo, tipo de explante e estádio de desenvolvimento do explante. Foram avaliadas diferentes regiões cotiledonares e período de maturação de embriões somáticos no estádio cotiledonar que produziriam maior quantidade de brotos. Na cultivar Rosinha, a região cotiledonar central foi a mais adequada para indução de organogênese e o período de 15 dias de maturação, o que produziu a maior quantidade de brotos em cotilédones. Diversos protocolos de transformação de mandioca foram desenvolvidos, mas nenhum deles tem aplicabilidade universal e os sistemas de seleção utilizados ainda geram muitos escapes ou são deletérios. Há mais de 1.500 cultivares de mandioca, contudo apenas um pequeno número foi utilizado com sucesso em processos de transformação. Entre os sistemas de transformação utilizados, na cultura da mandioca há preferência pela transformação via Agrobacterium tumefaciens para a produção de plantas transgênicas. Com o intuito de aumentar a eficiência de transformação, foram avaliados os parâmetros que afetariam a transformação via A. tumefaciens da cultivar Rosinha, por diminuírem a freqüência de histodiferenciação. Os fatores que interferem no processo foram a paramomicina na concentração de 500 mg/L e a estirpe bacteriana EHA105. Um fator de grande importância a ser determinado no processo de transformação é a dose do antibiótico, de maneira a impedir o aparecimento de falsos positivos sem interferir, ao mesmo tempo, no potencial regenerativo dos explantes usados na transformação. Foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações dos antibióticos canamicina e paramomicina em embriões somáticos nos estádios globular e cotiledonar. Das concentrações avaliadas, as concentrações de 10 mg/L de canamicina e 20 mg/L de paramomicina foram as escolhidas para a seleção de embriões em estádio globular da cultivar Rosinha. Já das concentrações avaliadas a concentração de 10 mg/L de paramomicina foi a escolhida para a seleção de embriões em estádio cotiledonar da cultivar Rosinha. A transformação via SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation) utiliza pulsos de ultra-som para ferir o tecido-alvo da transformação. O ferimento é um fator que pode ser manipulado e ter como resposta direta o aumento na eficiência do processo de transformação. Para avaliar a eficiência desse sistema de transformação, foram realizados experimentos que analisassem a resposta regenerativa dos explantes submetidos a SAAT e a freqüência da expressão do gene GUS. Foi verificado que SAAT aumentou de forma sensível a expressão transiente do gene GUS e a regeneração dos explantes foi pouco afetada pelo processo.