Purificação e caracterização de α-galactosidases do fungo Penicillium griseoroseum para utilização na hidrólise de oligossacarídeos de rafinose em derivados de soja

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Falkoski, Daniel Luciano
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: alfa-galactosidases; Soja; Oligossacarídeos; alpha-galactosidases; Soybean; Ologosaccharides; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2478

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência das α-galactosidases purificadas do fungo Penicillium griseoroseum na hidrólise dos RO presentes no extrato desengordurado de soja. Penicillium griseoroseum foi cultivado em meio mineral, contendo galactomanana como fonte de carbono, por 120 h, a 28 oC. Após este período, o meio foi centrifugado, dialisado e utilizado como fonte de enzimas α-galactosidases. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose, pH 5,0. A eluição das proteínas que aderiram a resina foi feita com um gradiente de NaCl de 0 a 0,3 M, sendo detectado dois picos protéicos distintos contendo atividade α-galactosidase, sendo a enzima detectada o primeiro pico protéico eluído denominada α-Gal I e enzima eluída no segundo pico denominada α-Gal II. As frações contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II foram reunidas, concentradas por ultrafiltração e submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições não desnaturantes. Ao termino das corridas eletroforéticas, os géis foram incubados em uma solução de ρ-NP-αGal (4 mg.mL-1) para determinar a localização das enzimas α-galactosidases. As regiões dos géis contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II, foram recortadas, maceradas e submetidas a agitação em tampão acetato de sódio, pH 5, 100 mM para extração e obtenção das enzimas purificadas. As enzimas α-Gal I e α-Gal II tiveram fatores de purificação de 155 e 53 vezes, respectivamente, com um rendimento final de 38 e 9 %, respectivamente. Atividades máximas de ambas as enzimas foram detectadas em pH 5,0 a 45oC. Os valores de meia vida da enzima α-Gal I a 40 e 45°C foram de 16 e 0,66 h respectivamente. Os valores de meia-vida da enzima α-Gal II a 40 e 45°C foram de 3,8 e 0,25 h respectivamente. Os valores da KM para ρ-NP-αGal, ο-PN-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima α-Gal I foram de 1,06, 1,31, 4,77, 19,99 e 28,74 mM, respectivamente, enquanto que, para a enzima α-Gal II foram de 0,80, 1,26, 5,10, 21,74 e 30,46 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando os substratos sintéticos ρ-NP-αGal, ο-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose. Sulfato de cobre, sulfato de ferro e cloreto de mercúrio inativaram completamente as α-galactosidases quando presentes em concentrações iguais 1 mM no meio de reação. Os resultados dos tratamentos de extrato desengordurado de soja com as enzimas α-Gal I e α-Gal mostraram uma redução de 100% de estaquiose pós-incubação a 40 oC, por 8 h. Houve redução de 69 e 12 % da rafinose após 8 h de incubação, a 40 oC, com as enzima α-Gal I e α-Gal II, respectivamente. A enzima α-Gal I foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e utilizada em ensaios de hidrólise de RO contidos em extrato desengordurado de soja, sendo verificado uma redução de 100 e 70% de estaquiose e rafinose, respectivamente, após 8 h de incubação. A enzima α-Gal I foi reutilizada 8 vezes consecutivas, em ensaios de hidrólise de RO, não sendo detectada nenhuma perda de atividade enzimática. Observa-se que as α-galactosidases de P. griseoroseum foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares.