Construção de um sistema de expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em Nicotiana tabacum "Havana" e análise da expressão do transgene

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Amaro, Marilane de Oliveira Fani
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos; Mestrado em Biologia Celular e Estrutural; UFV
• Palavras-chave em Português: Dengue; Nicotiana havana; Agrobacterium tumefaciens; Expressão heteróloga; Heterologous expression; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2322

A dengue é a doença mais importante causada por arbovírus no mundo, sendo observado nos últimos vinte anos um aumento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica, transmissão contínua de vários sorotipos e emergência da Febre hemorrágica (DHF) em áreas onde a doença não era prevalente. Apesar dos processos metodológicos de diagnóstico da dengue estar na atualidade em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho na realização de testes diagnósticos para dengue reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura do anticorpo presente no soro de pacientes infectados. Devido a este fator, o objetivo é a obtenção de antígeno em grandequantidade e qualidade utilizando um sistema de expressão heteróloga de proteínas em plantas. Para tanto, foi extraído o RNA total do sobrenadante de cultura de células infectadas e a partir deste foi sintetizado o cDNA. O gene da proteína não estrutural (NS1) do sorotipo dengue 2 foi obtido através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), separado por eletroforese e purificado. O gene foi, então, clonado em vetores pGEM-T e pCAMBIA. Bactérias Escherichia coli DH5α foram transformadas, selecionadas em meio seletivo e estocadas a -80º C. O vetor pCAMBIA foi anteriormente clivado com as mesmas enzimas e o gene da proteína NS1 foi ligado a este por enzima T4 ligase. Nova transformação de E. coli DH5α foi realizada e as colônias foram, então, analisadas quanto a presença do gene que codifica a proteína NS1 através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). As colônias transformantes recombinantes foram selecionadas e estocadas. Este vetor recombinante, pCAMBIA 3301/NS1, foi utilizado para transformação de Agrobacterium tumefaciens e, posteriormente, de Nicotiana tabacum para expressão da proteína não-estrutural NS1. A extração do DNA e do RNA proveniente das plantas do tabaco foi realizada. A integração do gene da proteína NS1 no genoma vegetal e sua transcrição foram confirmadas por PCR. Análises subsequentes serão realizadas para verificar a expressão efetiva da mesma, que será purificada e concentrada.