Melhoramento por evolução dirigida da termoestabilidade da xilanase xynA de Orpinomyces sp. PC-2

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Trevizano, Larissa Mattos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Evolução dirigida; Xilanase; Orpinomyces sp.; Directed evolution; Xylanase; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2408

Xilana é o polissacarídeo hemicelulósico mais comum da parede celular de plantas. Este polissacarídeo é composto por uma cadeia principal constituída exclusivamente por resíduos de xilose unidos por ligação β-1,4. Esta cadeia principal possui ramificações contendo resíduos de arabinofuranosil, acetil e glucuronosil. A hidrólise enzimática de xilanas é realizada por uma variedade de enzimas que são agrupadas pelo termo genérico de hemicelulases. Endoxilanases (EC 3.2.1.8) hidrolisam ligações β-1,4 internas da cadeia principal e geram oligossacarídeos de xilose solúveis. Uma variedade de microrganismos, incluindo bactéria, leveduras e fungos filamentosos têm sido descritos como produtores de xilanase, sendo que os mais potentes produtores são os fungos. Pesquisadores estão especialmente interessados em xilanases fúngicas porque elas são secretadas extracelularmente e sua atividade é muito maior que as xilanases provenientes de leveduras e bactérias. Dentre as aplicações biotecnológicas das xilanases, pode ser enfatizada a bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos fermentáveis, melhoria da digestibilidade de rações animais, clarificação de sucos, auxílio na liberação da lignina da polpa de celulose e redução da quantidade de cloro requerido para o branqueamento da polpa na indústria de papel. Nas últimas décadas, tem surgido um crescente interesse na bioconversão de lignocelulose como uma fonte de energia renovável, e xilanases podem ser efetivamente usadas, em associação com as celulases, para hidrólise de biomassa lignocelulósica e produção de bioetanol. Muitas das xilanases fúngicas mostram atividade ótima em pHs neutros ou ácidos e em temperaturas abaixo de 45 ºC. Xilanase (XynA), originalmente isolada do fungo anaeróbico Orpinomyces PC-2, foi testada para diversas aplicações industriais em escala piloto. Esta enzima apresentou atividade extremamente alta com o substrato xilana de ração animal, polpa de celulose e outros tipos de biomassa. Estudos demonstraram que o uso da enzima nativa foi mais eficiente em condições de pH 5.0-5.5 e temperatura de 50-55 ºC. No entanto, os processos industriais são normalmente realizados em temperaturas mais elevadas e em pH alcalino, o que justifica o interesse por xilanases que sejam ativas nestas condições. A metodologia de evolução dirigida do DNA surgiu como uma alternativa de sucesso na engenharia genética de enzimas e tem sido empregada para melhorar as propriedades funcionais dessas moléculas. Neste trabalho, a técnica de error-prone PCR foi utilizada para aprimorar a termoestabilidade da endo-β-1,4-xylanase de Orpinomyces PC-2. A biblioteca de mutantes (xynA) construída foi submetida a vários ciclos de screening. Os transformantes foram inicialmente expostos a 60 ºC durante uma hora e os mutantes termoestáveis foram selecionados com o substrato azo-xilana- agarose 0,2% pH 6,5. Seis mutantes selecionados foram seqüenciados e suas seqüências de aminoácidos foram analisadas para identificação das mutações. Dois mutantes apresentaram maior estabilidade térmica se comparado a xilanase sem mutações (tipo selvagem). Enquanto o tipo selvagem perdeu 60% de sua atividade depois de 10 min a 60 ºC, os mutantes M4 e M6 mostraram maior termoestabilidade e mantiveram aproximadamente 50% de suas atividades depois do tratamento a 60 ºC por 60 min. Em adição, M4 manteve cerca de 40% de sua atividade inicial depois de incubação a 75 ºC por 60 min. Com o objetivo de avaliar os efeitos das mutações nas propriedades das enzimas, estas foram caracterizadas quanto à temperatura ótima, pH ótimo e especificidade por substratos. Os mutantes e a xilanase tipo selvagem apresentaram temperatura ótima de 60 ºC e pH ótimo na faixa de 5,0-7,0 para atividade de xilanase. As enzimas apresentaram atividade com os dois substratos testados. Um estudo inicial de modelagem estrutural da xilanase tipo selvagem e duas mutantes, que apresentaram maior termoestabilidade, foi realizado, visando o melhor entendimento da relação entre estrutura e função dessas xilanases.