Perfil proteômico de podócitos editados geneticamente pela tecnologia CRISPR/Cas9 expressando características fenotípicas da doença de Fabry

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Monte Neto, Jose Tiburcio [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: Podócito; Doença de Fabry; CRISPR/Cas 9; Proteômica; Autofagia; Podocyte; Fabry disease; CRISPR/Cas9; Proteomic; Autophagy
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/65653

Introdução: Lesão dos podócitos e subsequente nefropatia crônica progressiva são características proeminentes da Doença de Fabry (DF), desordem de depósito lisossômico com padrão de herança ligada ao X provocada por mutações do gene GLA levando à atividade insuficiente da enzima α-GAL (α-galactosidase A). Embora as consequências clínicas tardias da nefropatia da DF sejam bem conhecidas, os eventos moleculares que deflagram a lesão podocitária carecem de estudos. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão diferencial de proteínas em podócitos humanos imortalizados com características fenotípicas da DF obtidas pela edição prévia do gene GLA através da tecnologia CRISPR/Cas9. Métodos: Os podócitos foram avaliados comparativamente: (i) quanto ao padrão proteico e processos biológicos alterados, através da abordagem proteômica e gene ontology (GO), (ii) quanto às vias de sinalização afetadas, por protocolo de western blot (WB) e RT-PCR e (iii) quanto à indução de apoptose, por meio de microscopia de fluorescência utilizando o marcador iodeto de propídio (IP). Resultados: A proteômica exploratória mostrou que as proteínas UCHL1 (<1,42x), HSP60 (<1,43x) e α-enolase1 (<1,61x) apresentavam significativa menor abundância nos podócitos geneticamente modificados em relação aos controles. A avaliação funcional por GO revelou que as proteínas alteradas encontram-se envolvidas nos processos biológicos seguintes: regulação da autofagia, apoptose e resposta ao VEGF. A análise comparativa por WB mostrou que os podócitos editados apresentavam significativa maior expressão das seguintes proteínas: (1) LC3B (>1,4x) e p62 (>1,7x), biomarcadores da autofagia, revelando inibição do fluxo autofágico. (2) TGF- (>1,5x), VEGF (>1,5x) e Vimentina (>2,3x), marcadores das vias pró-fibróticas, resposta vascular e transição epitélio mesenquimal, respectivamente; (3) PI3K 110 (>2,5x) e PI3K 110 (>1,45x), vias associadas com hipertrofia e apoptose. Paralelamente, os podócitos editados, em relação ao grupo controle, apresentaram significativa menor expressão de mRNA das proteínas estruturais podocalixina (<0,5x) e CD2AP (<0,4x) e, também, maior densidade de células apoptóticas. Conclusões: O presente estudo demonstrou que a deficiência de atividade da α-GAL, após a deleção do gene GLA por edição gênica CRIPR/Cas9, induz efeitos adversos sobre os podócitos, incluindo: (1) menor abundância das proteínas: UCHL1, HSP60 e α-enolase; (2) ativação de vias de sinalização adquirindo um padrão proliferativo, pró-fibrótico, de hiperreatividade vascular e desdiferenciação celular; (3) defeitos das vias proteolíticas pela inibição simultânea do sistema ubiquitina-proteassoma e da via autofágica e (4) maior apoptose. Essas alterações representam efeitos deletérios sobre a funcionalidade e viabilidade dos podócitos, podendo estar potencialmente implicadas na patogênese da nefropatia da DF.