Dupla localização da proteína de choque térmico Mdj1 em Paracoccidioides brasiliensis, identificação de elementos de transcrição na região 5' intergênica compartilhada pelos genes MDJ1/LON e avaliação da sua expressão gênica

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Batista, Wagner Luiz [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Proteínas de choque térmico; Paracoccidioides; Regulação da expressão gênica
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/21211

Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A.