Estudo de cisteíno peptidases do inseto Diaphorina citri, vetor da doença dos citros Huanglongbing, e seleção de compostos oxadiazólicos como inibidores das catepsinas B, L e K

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Calucio, Patricia Lima [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: Diaphorina citri; Huanglongbing; Catepsinas; Pseudoenzimas; Inibidores
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11600/71991

O Huanglongbing, doença mais devastadora da citricultura, é causado pela bactéria Candidatus Liberibacter e transmitido pelo inseto vetor Diaphorina citri. O combate ao vetor é feito com inseticidas, mas tem-se buscado outras formas de controle. Nos insetos, as cisteíno catepsinas são alvos importantes, pois atuam como enzimas digestivas, entre outras funções. Foram identificadas por proteoma do intestino do D. citri, oito catepsinas B e três catepsinas L. Dessas, nosso grupo já caracterizou uma catepsina B-like e uma L-like, altamente expressas no intestino de D. citri, sugerindo função digestiva. Estendemos esses estudos visando caracterizar duas outras catepsinas do inseto e buscar inibidores para as mesmas, o que poderá levar a estratégias para retardar o desenvolvimento e proliferação de D. citri. Em humanos, as cisteíno catepsinas, por possuírem uma variedade de atuações, tornam importante a busca por inibidores seletivos. Neste contexto e em busca de inibidores das catepsinas de D. citri, compostos sintéticos foram testados como inibidores das catepsinas humanas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram a identificação, produção recombinante e caracterização de catepsinas B-like e L-like de Diaphorina citri, e teste de compostos oxadiazólicos como inibidores das catepsinas recombinantes humanas B, L e K. Foram realizadas análises in sílico das catepsinas de D. citri DccathL2 e DccathB3; ensaios de expressão em Pichia pastoris; expressão em E. coli; solubilização, purificação e refolding das proteínas; e expressão em E. coli dos mutantes DccathL2mut e DccathB3mut. Em relação aos estudos de inibição de atividade catalítica das catepsinas recombinantes humanas B, L e K, foram testados quatorze compostos dipeptídicos 2-amino-1,3,4-oxadiazóis e nitrilas, os valores de Ki foram calculados e foi definido o modo de inibição. Como resultados desse trabalho, duas sequências de proteínas de D. citri do tipo catepsinas B-like e L-like foram selecionadas para expressão em Pichia pastoris, mas não houve a expressão nesse sistema. Foi possível a expressão em células de E. coli, na fração insolúvel. Seguindo diferentes protocolos de solubilização e refolding, não foi possível obter as catepsinas cataliticamente ativas. Após nova análise in silico, observou-se que ambas catepsinas possuiam uma mutação no sítio ativo, que promoveu a substituição do resíduo de cisteína por um resíduo de serina. Foram sintetizados mutantes, substituindo a serina por cisteína, mas ainda assim não foi possível obter as catepsinas cataliticamente ativas. Paralelamente, visando desenvolver potenciais inibidores sintéticos para as cisteíno catepsinas de D. citri, foram determinadas as constantes de inibição (Ki) de quatorze compostos oxadiazólicos e nitrilas frente às catepsinas recombinantes humanas B, L e K. O derivado 2-amino-1,3,4-oxadiazol denominado 10e foi 90 vezes mais seletivo para a catepsina L em relação à catepsina B. Foi determinado o modo de inibição que mostrou ser competitivo. Como conclusões desse trabalho, duas pseudo catepsinas do tipo B-like e L-like foram identificadas, pela primeira vez em D. citri, contendo um resíduo de serina no lugar do resíduo de cisteína do sítio ativo. As proteínas expressas não apresentaram atividade catalítica. A versão mutante de DccathL2, onde uma cisteína foi colocada no lugar do resíduo de serina no sítio ativo, também não apresentou atividade catalítica. Considerando as diferentes funções das pseudoenzimas e das catepsinas funcionais de D. citri, inferimos que as pseudo catepsinas exercem funções auxiliares às catepsinas funcionais. Em relação ao estudo de inibição das catepsinas humanas B, L e K, os compostos oxadiazólicos foram melhores inibidores do que os compostos nitrilas, e alguns deles se destacaram pela eficiência de inibição e seletividade entre as diferentes catepsinas humanas por nós estudadas.