Primeira descrição de heparam sulfato 3-o sulfotransferase em organismos primordiais: clonagem, expressão e atividade

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Meneghetti, Maria Cecilia Zorel [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Heparam sulfato; Heparina; O-sulfotransferase; Invertebrados
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2367149; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48544

Heparina é um polissacarídeo sulfatado heterogêneo amplamente utilizado como anticoagulante e antitrombótico. Acredita-se que diferentes padrões de substituições determinam funções biológicas específicas. Assim, uma importante modificação, a 3-O-sulfatação dos resíduos de glucosamina presente em uma estrutura pentassacarídica específica da heparina, é considerada de fundamental importância para a ligação da heparina à antitrombina (AT), que uma vez ativada inibe a coagulação sanguínea. Contudo, há relatos de que outras regiões da heparina apresentam a 3-O-sulfatação, que não estão relacionadas à afinidade a AT. Tal fato foi recentemente observado em estudo do nosso laboratório que demonstrou que um heparinóide, estrutura tipo HS/heparina, purificado do camarão L. vannamei, apesar de apresentar altos níveis de 3-O-sulfatação (15%) acima daquelas encontradas em heparinas de mamíferos (2-7%), não possui atividade anticoagulante. Assim, o objetivo do trabalho envolve a caracterização da 3-O-sulfotransferase (HS3ST) de L. vannamei a fim de buscar o melhor entendimento da função da 3-O-sulfatação na atividade anticoagulante e na regulação dessa modificação na biossíntese de HS/Hep. Sendo assim, relatamos a clonagem, a expressão e a atividade da HS3ST de L. vannamei. Para tal, o domínio da enzima HS3ST do camarão, responsável pela ligação ao HS/Hep, aceptor da enzima, e pela ligação ao PAPS, doador de grupamento sulfato, foi clonado em vetor de expressão pRSET A, e posteriormente, a enzima foi expressa em E. coli a 37°C e purificada em colunas de afinidade para His-tag a 4°C, condição que não prejudicou a atividade da enzima recombinante. Em estudos comparativos com as isoformas da 3-O-sulfotransferase humana, as isoformas 1 e 5, relacionadas na produção do HS anticoagulante, apresentaram maior identidade com a HS3ST de L. vannamei tanto em relação à sequência gênica quanto em relação à sequência de aminoácidos e à estrutura proteica. Além disso, de acordo com programas específicos de predição de domínios, a HS3ST é uma proteína de membrana, possuindo três domínios: citoplasmático, transmembrânica e luminal. Posteriormente, foram realizados ensaios de atividade enzimática, nos quais a HS3ST apresentou atividade frente aos substratos heparina O,N-dessulfatada-N-resulfatada e heparina O,N-dessulfatada-N-reacetilada, indicando que a enzima recombinante é uma O-sulfotransferase modificadora de HS/Hep, além de contrariar a teoria hierárquica da biossíntese de HS/Hep, uma vez que a N-acetilação não foi impeditiva para a ação da HS3ST. Além disso, a ação da HS3ST foi seletiva ao tamanho da cadeia de açúcar ao sulfatar apenas oligossacarídeo constituído de 20 monossacarídeos. Soma a isso, o fato que as heparinas 3-O-modificadas pela HS3ST recombinante foram incapazes de estabilizar a AT e, consequentemente, não possuem atividade anticoagulante. Dessa maneira, os dados mostram que a HS3ST não segue a rigor a via tradicional de biossíntese da heparina além de indicar que apenas a presença de 3-O-sulfatação em heparinas não é essencial para a atividade anticoagulante.