Eletroporação e estabilidade de membranas aniônicas com diferentes níveis de complexidade

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Leomil, Fernanda dos Santos Costa [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: Membranas; Assimetria; Eletroporação; Tensão de linha; GUVs; Microscopia ótica
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11600/65192

A estabilidade das membranas celulares é de importância vital para as células. Após estímulos de alta intensidade, como os causados pela aplicação de pulsos elétricos, poros são abertos na membrana (eletroporação) e se fecham em poucos ms, permitindo que a integridade da membrana seja preservada, conforme observado em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) neutras de PC (fosfatidilcolina). No entanto, a adição do lipídio negativo PG (fosfatidilglicerol) mostrou desempenhar um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação: (i) alguns poros se abrem indefinidamente, levando à completa perda da integridade da vesícula (bursting) e (ii) GUVs que sobreviveram à poração exibem permeabilidade de longa duração, revelando a permanência de poros submicroscópicos após o fechamento dos macroporos. Nesta tese, foi investigada a resposta mecânica de GUVs a campos elétricos, com foco na estabilidade de membranas contendo frações crescentes de lipídios aniônicos de conhecida relevância biológica, como o fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), cardiolipina (CL), fosfatigilglicerol (PG) e extrato lipídico de E. coli, bem como foi examinada a relevância da assimetria dos lipídios negativos entre as monocamadas na estabilidade dessas membranas. Também foram explorados sistemas mais complexos, como vesículas gigantes de membrana plasmática (GPMVs), que representam um passo intermediário entre GUVs lipídicas e células, apresentando as características lipídicas e proteicas das células que as originaram. Métodos experimentais e computacionais foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo do trabalho para a realização e análise dos experimentos executados. Em GUVs com distribuição simétrica de lipídios aniônicos, medidas da ocorrência de eventos desestabilizantes, como bursting e permeabilidade duradoura, mostraram que as membranas contendo frações mais altas de lipídios negativos (50 mol%) são mais instáveis e propensas à desestabilização. Esses efeitos, que se mostraram independentes do tipo de lipídio negativo utilizado, foram relacionados a uma redução de cerca de 50% na tensão de linha do poro, propriedade que governa o seu fechamento e que foi calculada através de um software desenvolvido durante o projeto (PoET). GUVs com distribuição assimétrica de lipídio negativo entre as monocamadas da membrana foram obtidas por dois métodos diferentes: transferência de fase e alterações do pH do meio externo das vesículas. A assimetria foi verificada por meio de um ensaio de supressão de fluorescência aperfeiçoado ao longo do estudo, em combinação com um algoritmo desenvolvido para medidas de fluorescência em GUVs. Eventos desestabilizantes foram observados já para pequenos graus de assimetria de carga (5 mol%), que potencializam a ocorrência de eventos mais extremos, como o bursting, devido à geração de curvatura espontânea acentuada. Quando consideramos modelos ainda mais relevantes, resultados preliminares mostram que existem diferenças na forma com que GPMVs e GUVs respondem a pulsos elétricos, provavelmente devido à maior complexidade exibida pelas membranas das GPMVs. Os resultados apresentados aqui evidenciam que os lipídios aniônicos possuem um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação, sendo os efeitos realçados no caso em que estes estão assimetricamente distribuídos entre as monocamadas das membranas, como observado nas membranas celulares. Acreditamos que os achados possam contribuir para o desenvolvimento de sistemas de entrega intracelular de drogas baseados em eletroporação mais eficientes. Ainda, julgamos que o aperfeiçoamento do ensaio de supressão de fluorescência e o desenvolvimento do software para cálculo da tensão de linha e do algoritmo para medidas de fluorescência serão de grande contribuição para a comunidade científica, permitindo a realização de experimentos e obtenção de dados de forma mais confiável e reprodutível.