Papel do complexo Ikaros-HDAC na regulação da expressão de micro-RNAs apoptóticos por linfócitos B-1

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Costa, Lucas Vasconcelos Soares [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: Linfócitos B-1; Leucemia linfocítica crônica; Ikaros; Micro-RNA; Apoptose
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11600/70950

Os linfócitos B-1, um subtipo de células B, podem expressar o marcador CD5 e são responsáveis pela produção de IgM natural. Além disso, são capazes de autorrenovação e reconhecimento de autoantígenos, o que poderia facilitar sua diferenciação em células hiperproliferativas. De fato, estas células estão envolvidas no desenvolvimento da leucemia linfocítica crônica (LLC), caracterizada pelo aumento de células B-1 com expressão de CD5 e IgM, além de BCR responsivo a autoantígenos. A principal característica da LLC é a intensa atividade proliferativa de linfócitos B-1 CD5+CD23+ na medula óssea e órgãos linfoides e consequente acúmulo de células resistentes à morte no sangue periférico. Dentre as moléculas envolvidas na patogênese, os fatores de transcrição da família Ikaros (Ikzf1) encontram-se alterados. A principal forma de atividade de Ikaros se dá pela associação a complexos, que envolvem a presença de histonas deacetilases (HDAC) em especial a HDAC1 e HDAC2. No contexto da LLC, foi descrito que as HDACs se encontram, em sua maioria, super expressas e isto influencia na expressão de micro-RNAs (miRNAs) envolvidos na regulação da apoptose intrínseca. Assim, a proposta deste trabalho é investigar o papel de Ikaros na expressão de microRNAs e moléculas envolvidas na via de apoptose, a fim de fazer uma correlação com a LLC. As células B-1 murinas foram obtidas do peritônio de camundongos C57Bl/6 após o enriquecimento por cell sorting. Primeiramente foi confirmada a co-localização e interação de Ikaros e HDAC1 em células B-1 por imunofluorescência e co-imunoprecipitação respectivamente. A seguir, a expressão de Ikaros foi silenciada nestas células por siRNA e neste cenário, além de uma maior viabilidade celular, foi observado um aumento significativo na síntese de HDAC1 e c-Myc. Em nível proteico, observamos que a perda de Ikaros regula negativamente quase todas as proteínas apoptóticas analisadas. No estudo mais específico das moléculas da via, houve o aumento na expressão de Bcl-2 e da forma clivada da caspase-3, condizentes com o aumento da viabilidade. O array de miRNAs revelou a mudança na expressão de 37 miRNAS, dentre eles a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145. O tratamento com um inibidor de HDACs, além de diminuir a viabilidade celular independente de Ikaros, restaurou os níveis do miR-29c na ausência de Ikaros mas não do miR-145. A super expressão do miR-29c foi capaz de reduzir os níveis de Bcl-2 e aumentar a expressão de Bax, enquanto a super expressão de miR-145, além de reduzir os níveis de c-Myc, aumentou a expressão do miR-29c e diminuiu Bcl-2 e MCL-1. No ensaio funcional, o miR-29c foi capaz de reverter os efeitos da ausência de Ikaros, mas a restauração do miR-145 e a combinação de ambos os miRNAs pareceu levar estas células à morte, além de modular a razão Bcl-2/Bax. Em um segundo modelo de estudo, investigamos a ausência de Ikaros em células B-1 no ambiente medular. Neste modelo, foi observado aumento significativo na viabilidade das células silenciadas sob co-cultura com linhagem células do estroma medular (OP9). Ainda, houve a mudança na expressão de 42 miRNAS, mas a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145 se manteve. Os efeitos da inibição das HDACs e da restauração dos miRNAs se manteve como no modelo anterior mesmo com os estímulos fornecidos pelas células estromais. Assim, estes dados confirmam a participação de Ikaros na regulação de moléculas envolvidas na sobrevivência das células B-1, e os mecanismos incluem HDACs e o fator de transcrição c-Myc. Além disso, estes dados indicam que a baixa expressão dos miRNAs -145 e -29c, devido à desregulação de Ikaros, poderia ser uma das vias moleculares para induzir resistência à apoptose em células B leucêmicas. Por fim, foi postulado o miR-145 como um possível alvo terapêutico para a LLC.