Desenvolvimento e validação de método analítico in vitro para determinação de potência de produtos farmacêuticos com o ativo eritropoietina

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Camargo, Bruno Taborda Paes [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: EPO; TF-1; In vitro; Método alternativo; Validação analítica; Alternative method; Analytical validation
• Link de acesso: https://hdl.handle.net/11600/72285

O hormônio glicoproteico, eritropoietina humana (EPO) atua sobre as células predecessoras de eritrócitos estimulando sua proliferação, diferenciação, maturação e inibindo a apoptose, aumentando assim a produção de eritrócitos. A EPO é utilizada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica, tratamento de anemias associadas ao câncer, infecção por HIV, pré e pós-operatório, artrite reumatoide e transplante de medula óssea. Com o avanço da biotecnologia e o surgimento de técnicas de DNA recombinante, a EPO pode ser produzida em grande escala em Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) para a produção de medicamentos. O teste de potência da EPO é descrito ainda hoje, em compêndios oficiais, como um teste realizado em animais (in vivo), porém com o crescente cuidado ético no uso de animais em experimentos, os gastos com biotérios e a variabilidade dos resultados, iniciou-se o desenvolvimento de um método alternativo (in vitro). Utilizando uma linhagem celular não aderente predecessora de eritrócitos (TF-1), a metodologia em desenvolvimento é baseada em uma técnica colorimétrica e avalia a viabilidade e se as células estão metabolicamente ativas após estímulo com a EPO. Foram testadas variações analíticas para a técnica colorimétrica sendo que algumas dessas variações apresentaram resultados atisfatórios com curva de concentração resposta apresentando correlação forte para uma curva polinomial de segunda ordem. Foram realizadas em paralelo análises de espectrometria de massa e microscopia confocal para confirmar e avaliar a ação da EPO sobre a TF-1. A espectrometria de massa avaliou a regulação de proteínas intracelulares mediadas pela EPO e os resultados mostraram que 4 proteínas só puderam ser identificadas após a TF-1 receber estímulo da EPO, sendo estas proteínas de núcleo celular e estruturais. A Microscopia confocal avaliou a morfologia celular em cultivos com diferentes concentrações de EPO e foi possível visualizar que morfologicamente às células ficaram apresentaram modificações conforme a concentração de EPO aumentou na cultura. O método em desenvolvimento mostrou-se promissor, respondendo positivamente a avaliação de atividade celular, entregando uma curva de concentração resposta dependente da concentração de EPO utilizada no estímulo das células além dos ensaios de espectrometria e microscopia confirmarem que a linhagem celular responde ao estímulo do hormônio. Na sequência do trabalho, foi realizada a validação da metodologia desenvolvida, que entregou resultados dentro dos parâmetros estabelecidos para seletividade, linearidade, precisão, exatidão. A faixa de trabalho e os limites de detecção e de quantificação também puderam ser determinados. A metodologia in vitro proposta se mostra uma alternativa para substituição da metodologia in vivo atualmente descrita em compêndios oficiais.