| Resumo: |
A antracnose causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides sensu lato é uma importante doença em diversas culturas, dentre elas a mandioca. Devido a dificuldade de identificação do patógeno por meio de características morfológicas, métodos moleculares vêm sendo utilizados no auxílio de diferenciação e identificação do patógeno. O presente estudo teve por objetivo testar métodos moleculares na diferenciação de linhagens filogenéticas de C. gloeosporioides sensu lato que possam ser utilizados para o direcionamento do sequenciamento. Desta forma, materiais vegetais que apresentavam sintomas da doença foram coletados em 17 cidades pertencentes ao Recôncavo da Bahia para a realização do isolamento e obtenção de culturas monospóricas do patógeno. Folhas sadias de mandioca foram utilizadas para a inoculação do patógeno e teste de patogenicidade. Duas estratégias foram utilizadas, sendo a primeira o agrupamento dos isolados por meio de regiões repetitivas BOX e ERIC; e segunda técnicas baseadas em PCR-RFLP realizadas in silico e in gel. Para a análise das regiões repetitivas, os produtos de PCR foram corridos em gel de agarose 1,5%, seguido de análise das bandas apresentadas. Para a análise dos dados, os padrões de bandas apresentados nos géis foram convertidos em matrizes sendo ‘0’ ausência da banda e ‘1’ presença. As matrizes binárias obtidas foram utilizadas para estimativa de distância genética e construção de dendrogramas. Enquanto que para a técnica de PCR-RFLP, análises in silico foram realizadas para a determinação das regiões gênicas de maior potencial de separação das linhagens filogenéticas do complexo, bem como as melhores combinações de enzimas de restrição a serem utilizadas. Após a escolha da região, foram realizados ensaios in gel (amplificação por PCR e digestão com enzimas de restrição). Os produtos da clivagem foram observados em gel de agarose 2%. Para as regiões repetitivas, o BOX-PCR apresentou um baixo polimorfismo para os isolados testados, enquanto que a amplificação baseada em ERIC-PRC apresentou um maior grau de polimorfismo, e permitiu um melhor agrupamento de indivíduos e separação de algumas linhagens filogenéticas dentro do complexo C. gloeosporioides. O uso conjunto de dados do BOX e ERIC-PCR diminuiu a capacidade discriminatória apresentada somente por ERIC. Em relação à técnica de PCR-RFLP, a combinação (região de interesse + enzima de restrição) que apresentou maior potencial discriminatório das linhagens filogenéticas foi a Calmodulina (CAL), nas análises in silico. Sendo que as enzimas que apresentaram melhor resultado foram AluI, BsuRI, HhaI, HinfI, MspI e TaqI. A validação destas análises in gel permitiu observar os mesmo padrões esperados das análises in silico, inclusive, possibilitanto a utilização de dados “híbridos”, ou seja, estimativa da provável linhagen filogenética dos indivíduos com base no padrão esperado para cada uma das espécies do complexo C. gloeosporioides gerados nas análises in silico, comparando-os com os padrões de banda obtidos nas análises in gel. A utilização de ERIC-PCR e CAL PCR-RFLP na diferenciação de linhagens filogenéticas pertencentes ao complexo C. gloeosporioides mostrou-se eficiente na diferenciação de espécimes, podendo ser utilizada como ferramentas de auxílio na identificação e direcionamento do sequenciamento. |
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