Produção e imobilização covalente da inulinase obtida a partir de microrganismos isolados de frutos nativos da região Amazônica (Colômbia)

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Ferreira, Marcela Vega
• Orientador(a): Rombaldi, César Valmor
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Pelotas
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
• Departamento: Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Araçá-boi; Aspergillus niger; DNA; Electroforese; Expressão; Extração; Grafeno oxidado; Imobilização; Inulina; Inulinase; ITS; Meio de cultura; Produção; Purificação; RNA; Sequenciamento; Transcriptômica; Yacon
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::AGRONOMIA
• Link de acesso: http://guaiaca.ufpel.edu.br/handle/prefix/8320

As inulinases são β-frutosidases inespecíficas que hidrolisam a inulina em frutooligossacarídeos (FOS), frutose e um pouco de glicose. Os xaropes de frutose são amplamente utilizados como adoçantes na indústria de alimentos. A frutose é obtida da inulina por uma simples reação enzimática com inulinases que produzem 95% de frutose. O presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar inulinases a partir de fungos filamentosos e leveduras isolados e identificados de polpa de frutos da região Amazônica como: Cupuaçu (Theobroma grandiflorum), Araçá-boi (Eugenia stipitata McVaugh) e Cubiu (Solanum sessiliflorum). A pesquisa foi organizada em três capítulos. O Capítulo I aborda uma visão geral de todos os microrganismos identificados fenotipicamante pelo método API com potencial para produzir inulinase por fermentação submersa usando inulina (Yacon) como fonte de carbono e diferentes tempos. A partir dessa avaliação foram escolhidos seis morfotipos (1, 3, 5, 10, 17 e 21) e o tempo 48 horas como a melhor condição para produção da enzima. O Capítulo II descreve os métodos de extração de DNA e RNA para a identificação molecular que foi realizado com os seis morfotipos selecionados e a transcriptômica do morfotipo No.3 escolhido por sua característica de status GRAS (seguro). Os microrganismos foram identificados em gênero e espécie usando a região ITS e 18S do DNAr pelo método SANGER e comparando as sequências in sílico com outras depositadas na NBCI, usando o programa BLAST. A expressão dos genes de inulinase foram avaliados a partir de RNA pela tecnologia de nova geração RNAseq Solexa/Illumina e análises de bioinformática. O Capítulo III descreve a produção de inulinases apartir do morfotipo No.3 identificado como Aspergillus niger, usando meios de cultura contendo diferentes fontes de carbono (M1, M2, M3 e M6), parcialmente purificadas com resina DEAE Sephacel equilibrada com NaCl 0,25M, imobilizadas em grafeno oxidado (GO), caracterizadas bioquimicamente e com avaliação em armazenamento a 6 ºC. Na eletroforese SDSPAGE uma banda de proteína com peso molecular em torno de 97 kDa foi observado. Os melhores resultados foram obtidos usando o meio de cultura M2 contendo inulina para produzir a enzima extracelular, um pH 4,5 e temperatura de 70 ºC, Km igual a 5,2 mg.mL-1 e Vmax de 40 U.mg -1 para enzima imobilizada, com um rendimento acima de 80%, sete ciclos de resuso e estabilidade de 34% após 30 dias de armazenamento em refrigeração (6 ºC).