Avaliação bioquímica da diversidade genética de linhagens de Chromobacterium violaceum e caracterização molecular do gene de quitinase

• Ano de defesa: 2007
• Autor(a) principal: Luiza Ribeiro Bastos da Silva, Maria
• Orientador(a): Maria de Campos Takaki, Galba
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Pernambuco
• Palavras-chave em Português: Diversidade genética; Endoquitinase; Quitinase A; Chromobacterium violaceum
• Link de acesso: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/2124

Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnológico demonstrado foi através do genoma seqüenciado da C. violaceum ATCC 12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossíntese de quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genética de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para análise do sistema quitinolítico. As linhagens foram crescidas no meio Luria Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos e do gene 16S rDNA, e a diversidade genética, pela técnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a caracterização das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a biossíntese de quitina, utilizando células crescidas em meio Luria Bertani (LB) com e sem a presença de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade quitinásica (gel de atividade e ensaios enzimáticos com dímero e trímero) e proteínas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE, corados com Azul de Coomassie G-250 e os géis da atividade quitinásica foram corados com calcofluor. Para a caracterização do gene de quitinase foram utilizadas seqüências codificadoras de quitinase A e endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genômico de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), usando oligonucleotídeos específicos. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Os resultados do perfil de ácido graxos e 16S rDNA permitiu a caracterização das linhagens e o rep-PCR demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade genética. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil diferenciado de atividade quitinolítica em gel desnaturante com a presença de glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintéticos (N,N - diacetilquitobiose e N, N , N -triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos ossubstratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade quitinolítica foram observados usando-se o cromóforo diacetilquitobiose. A seqüência codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439 aminoácidos, correspondendo ao domínio quitinase (CDD:29557) da família 19 da glicosil hidrolase (257 aminoácidos), formada por enzimas que catalisam e hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polímero de quitina. Além desta região, as bases restantes proporcionaram a formação de dois sítios, um putativo para a construção de açucares e outro constituído por resíduos catalíticos. A seqüência correspondente ao produto do gene Cv2935 sugere uma provável quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), sendo formada por 439 aminoácidos. Observou-se duas regiões: i) a ChtBD3 como um domínio obrigatório para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799; ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsável pelo transporte e metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a família 18 da glicosil hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando também, ambos aspectos biotecnológico de produção das enzimas quitinase A (exoquitinase) da família 18 e a endoquitinase da família 19