Leishmania : caracterização molecular, PCR em tempo real para o diagnóstico da leishmaniose visceral e diversidade genética de kDNA

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Lima Junior, Manoel Sebastião da Costa
• Orientador(a): Matos, Maria de Fátima Cepa
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Leishmania - parasitologia; Leishmania - parasitology; Reação em Cadeia da Polimerase; Polymerase Chain Reaction; DNA de Cinetoplasto; DNA, Kinetoplast
• Link de acesso: https://repositorio.ufms.br/handle/123456789/1869

As leishmanioses são um complexo de diferentes enfermidades ocasionadas por distintas espécies do gênero Leishmania. Estas doenças de evolução crônica podem afetar a pele, mucosas e vísceras dependendo da espécie de Leishmania e da resposta imune do hospedeiro. Os objetivos do presente trabalho foram: identificar por meio da Reação em Cadeia da Polimerase - PCR as espécies dos agentes etiológicos da leishmaniose visceral e tegumentar em pacientes diagnosticados em Campo Grande-MS; avaliar a PCR em tempo real (PCR-TR) em amostras de sangue periférico para diagnóstico da leishmaniose visceral e detectar variabilidade genética em kDNA de Leishmania isolada de pacientes com leishmaniose visceral e/ou cutânea. Foram analisados 39 isolados de Leishmania criopreservados, obtidos por meio de aspirado medular e/ou biópsia de lesão, conforme a suspeita clínica. Os isolados foram submetidos à extração de DNA e à PCR com os iniciadores RV1/RV2 para Leishmania (Leishmania) chagasi, a1/a2 para a identificação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e b1/b2 para Leishmania (Viannia) braziliensis. Foi realizada a análise comparativa entre exames moleculares (PCR-TR - sistema Sybr Green Rox Plus e PCR padrão) em sangue periférico e técnicas parasitológicas (aspirado de medula e cultura). Foram utilizados 100 amostras de sangue periférico provenientes de pacientes com suspeita clínica de leishmaniose visceral. Por meio da cultura obteve-se outros 47 isolados de Leishmania, que foram submetidos ao sequenciamento da região ITS e a PCR-RFLP com os iniciadores LINR4/LIN19 e enzimas RsaI e HpaII. Leishmania (Leishmania) chagasi foi a única espécie identificada em 37 casos de leishmaniose visceral. Leishmania (Leishmania) amazonensis foi identificada em dois isolados de pacientes com diagnóstico de leishmaniose tegumentar. Das 100 amostras analisadas, 65 (65%) foram positivas para PCR, 62 (62%) para PCR-TR e 45 (45%) para o esfregaço de aspirado de medula óssea e das 96 amostras, 13 (13,54%) foram positivas na cultura. A PCR-TR mostrou maior concordância com a PCR (95%) seguida do esfregaço de medula óssea (83,0%) e cultura (53,1%). A análise genética dos 47 isolados de Leishmania forneceu 30 genótipos diferentes e pela comparação das regiões ITS1 com as sequências depositadas no Genebank foi identificado na maioria das amostras de leishmaniose visceral (44), L. chagasi como agente etiológico e nos casos de leishmaniose tegumentar identificou-se L. braziliensis e L. major. Os resultados confirmaram a possibilidade do uso dos três pares de iniciadores como ferramenta na caracterização de isolados de Leishmania, a PCR-TR em sangue periférico mostrou ser uma alternativa de diagnóstico da leishmaniose visceral a partir de amostras coletas por método menos invasivo e a técnica PCR/RFLP detectou elevada variabilidade genética em kDNA de Leishmania (Leishmania) chagasi de casos humanos de Mato Grosso do Sul.