Desenvolvimento e otimização de sistemas de expressão de proteínas recombinantes em capim-elefante e em tabaco
| Ano de defesa: | 2023 |
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| Autor(a) principal: |
Paiva, Vívian Caiafa Ferreira
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| Orientador(a): |
Santos, Marcelo de Oliveira
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| Banca de defesa: |
Medeiros, Julliane Dutra
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| Tipo de documento: | Dissertação |
| Tipo de acesso: | Acesso aberto |
| Idioma: | por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
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| Programa de Pós-Graduação: |
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
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| Departamento: |
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
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| País: |
Brasil
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| Palavras-chave em Português: | |
| Área do conhecimento CNPq: | |
| Link de acesso: | https://doi.org/10.34019/ufjf/di/2023/00071 https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/15868 |
Resumo: | Os avanços da biotecnologia atrelados ao melhoramento genético permitiram modificações genéticas mais precisas e controladas para a obtenção de características desejáveis nos organismos. Plantas transgênicas são uma opção atrativa na agricultura e na indústria farmacêutica, fornecendo resistência a doenças e a estresses ambientais, bem como permitindo a produção de proteínas recombinantes e de metabólitos secundários de interesse terapêutico. O capimelefante (Pennisetum purpureum Schumach syn. Cenchrus purpureus Schumach) é uma gramínea amplamente utilizada como forragem de elevado potencial de produção de matéria seca na pecuária leiteira e de corte. Todavia, insetos de alto potencial de danos às culturas, como as cigarrinhas das pastagens, podem impactar a produtividade da gramínea. O desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes às pragas é uma alternativa viável para contornar essa problemática. No presente trabalho, objetivamos a obtenção de um protocolo de regeneração visando a transformação de capim-elefante cultivar BRS Capiaçu via Agrobacterium tumefaciens. Foi realizada a indução de gemas laterais em diferentes combinações de reguladores de crescimento 2,4D, BAP e TDZ, com a obtenção de 93% de regeneração de múltiplos brotos induzidos por 28 dias em tratamento contendo 0,1 mg.L-1 2.4-D e 2 mg. L-1 BAP, com curva de seleção determinada de 50 mg. L-1 de Canamicina e três dias como período de pré-cultivo. Os brotos regenerados apresentaram bom desenvolvimento radicular e de parte aérea e o tratamento com canamicina permitiu determinação da curva de seleção. No segundo capítulo deste documento, objetivamos caracterizar a expressão de transgene para a produção de um anticorpo recombinante de cadeia simples scFAB-anti-IL1ß a partir da obtenção de linhagens homozigotas estáveis de Nicotiana benthamiana. Este anticorpo foi sintetizado devido à importância biológica em doenças inflamatórias relacionadas com o aumento prolongado da citocina IL-1ß. Dessa forma, pretendemos a seleção de linhagens de N. benthamiana para a produção estável do anticorpo scFAB-anti-IL1ß. Para isso, sementes de plantas transgênicas foram avaliadas quanto à presença do gene que expressa scFAB-anti-IL1ß em placas contendo meio MS com o agente de seleção canamicina. As plantas transgênicas apresentaram taxas de germinação entre 48,59% para o evento IL-1ßT0P22 e de 95,53% para o evento IL-1ßT0P20. As plântulas T1 advindas do evento IL-1ßT0P20 foram subcultivadas e (i) comparadas com plantas T0 hemizigotas pelo método 2−ΔΔCt , com valores normalizados com gene endógeno 18S rRNA e (ii) submetidas à extração e purificação de proteínas. A produção de scFAB-anti-IL1ß pelas regenerantes T1 apresentou rendimento aproximado de 474 µg por grama de folha fresca. Com análise dos dados do qPCR e do RT-qPCR, verificou-se a presença de linhagens com valores estimados para duas cópias para o transgene na proporção esperada de 2:1. Todavia, os indivíduos tendenciaram ao silenciamento gênico, com redução na expressão do transgene. |