Produção e avaliação de modelos de cultivo celular para teste de RNAs guia para o sistema CRISPR-Cas9

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Souza, Gustavo Torres de
• Orientador(a): Camargo, Luiz Sérgio de Almeida
• Banca de defesa: Maranduba, Carlos Magno da Costa , Santos, Marcelo de Oliveira, Saraiva, Naiara Zoccal
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
• Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Edição gênica; Engenharia genética; Transgenia animal; AGMs; CRISPR-Cas9; Beta-lactoglobulina; Receptor de prolactina; Embriões; Gene editing; Genetic engineering; Animals; Transgenics; GMAs; Beta-lactoglobulin; Prolactin receptor; Embryos
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
• Link de acesso: https://doi.org/10.34019/ufjf/te/2023/00013; https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/15793

Contexto: O sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 tem se mostrado uma ferramenta poderosa para modificações genéticas direcionadas. Esta tese de doutorado buscou otimizar o sistema CRISPR-Cas9 para utilização em linhagens celulares bovinas e embriões. Métodos: Foram desenhados e produzidos sgRNAs específicos visando loci de interesse para edição gênica em células epiteliais mamárias bovinas (MDBK). Adicionalmente, células MDBK expressando estavelmente a proteína Cas9 foram geradas. A atividade dos sgRNAs foi avaliada in vitro, e RNA mensageiros (mRNA) reportadores foram utilizados para confirmar a eficiência da transfeção. A seleção por antibiótico foi empregada para promover a expressão estável da Cas9 em linhagens celulares humanas e bovinas. A eficiência da edição gênica em embriões também foi avaliada por meio de PCR e sequenciamento.Resultados: A avaliação in vitro da atividade dos sgRNAs em células MDBK demonstrou variações na eficiência de edição, destacando a necessidade de linhagens celulares expressando a Cas9 com genomas relevantes. O método do mRNA reportador demonstrou sua utilidade para confirmar a eficiência da transfeção. A seleção por antibiótico promoveu com sucesso a expressão estável da Cas9 em linhagens celulares humanas e bovinas. A edição gênica em embriões resultou em uma proporção total de edição de 48%, sendo a maioria das células mutantes (35,5%) apresentando uma deleção de um nucliotídeo. Conclusão: Os sgRNAs desenhados permitiram a edição gênica em linhagens celulares bovinas MDBK, e o modelo otimizado do sistema CRISPR-Cas9 mostrou-se eficaz para editar os loci alvo em embriões. Esses resultados contribuem para o avanço da engenharia do genoma bovino, oferecendo aplicações potenciais em futuros estudos envolvendo o sistema CRISPR-Cas9 para a edição do genoma bovino.