Análise do processo da penetração à colonização de Fusarium decemcellulare em guaranazeiro e obtenção de mutantes para genes relacionados à patogenicidade por meio de CRISPR/Cas9

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Fernandes, Joelma dos Santos
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/8884118027809527
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Plantas - Melhoramento genético; Guaraná - Melhoramento genético; Melhoramento genético - Pesquisa; CIENCIAS BIOLOGICAS; Transformação genética; Interação patógeno-hospedeiro; Knockout gênico via CRISPR/Cas9; Proteínas fluorescentes; Guaranazeiro
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/9577

Diante da necessidade de entender os mecanismos de interação entre Fusarium decemcellulare e o guaranazeiro, bem como analisar genes que possam ter papel importante na patogenicidade e/ou na virulência, este trabalho teve como objetivo analisar o processo de interação patógeno-hospedeiro, por meio: 1- do estabelecimento de condições eficientes para transformação genética de F. decemcellulare (Fdc) e a obtenção de linhagens transformantes expressando as proteínas GFP (Green fluorescent protein) e RFP (Red fluorescent protein) para aplicação na análise da penetração e colonização; 2- da identificação da forma de colonização do Fdc em guaranazeiro para auxiliar no estabelecimento de métodos de controle da doença; e 3- da obtenção de linhagens de Fdc com knockout para genes relacionados à produção de auxina pelo patógeno. Nos resultados evidenciamos que, o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) não possibilitou a obtenção de transformantes de Fdc, enquanto a transformação via polietileno glicol (PEG) apresentou eficiência média de três transformantes por µg de DNA expressando as proteínas fluorescentes GFP ou RFP. Estes transformantes foram então utilizados nos estudos sobre a colonização do patógeno na planta, analisada por meio de microscopia confocal e de varredura. As análises mostraram que o Fdc apresenta colonização do tipo sistêmica, tanto em tomateiro quanto em guaranazeiro, sendo isolado a montante e a jusante do ponto de inoculação com 30 a 120 dias em ambas as plantas, porém necessita de ferimentos para ter sucesso no processo de penetração. Apresenta ainda, alta associação aos tricomas intactos e rompidos em guaranazeiro, não sendo observada preferência por invasão, como por exemplo, através de aberturas naturais (estômatos). Neste trabalho, além dos relatos sobre complexo superbrotamento estamos relatando pela primeira vez em guaranazeiro sintomas que se assemelham aos da doença de Dieback causada pelo F. decemcellulare. O método de transformação aqui estabelecido também foi útil como primeiro passo para etapa do processo de edição do genoma por meio do sistema CRISPR/Cas9 em Fdc, o qual foi avaliado quanto à obtenção de knockout único ou triplo. Foram obtidos 23 tranformantes, destes nenhum apresentou duplo ou triplo knockout, e para deleção de um único gene foram obtidos oito transformantes, sendo três com knockout para o gene aldh localizado no cromosso 9, quatro knockout para o gene aldh no cromosso 2 e um para o gene yucca.