Expressão de fosfatase alcalina em Escherichia coli sob o controle do sistema de regulação do operon lac

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Franco, Vanessa Correa
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/0765176510381097
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Expressão enzimática; Fosfatase Alcalina; Operon lac; Escherichia coli; sistema de regulação; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
• Link de acesso: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5332

A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando-se o gene no plasmídeo pBR322. Posteriormente o gene estrutural phoA foi transferido para o vetor pAC92, derivado do pUC18, onde sua expressão ficou parcialmente regulada, originando o plasmídeo recombinante capaz de programar em E. coli maior nível de expressão. Porém este vetor possui a necessidade do controle da expressão com glicose no meio, do contrário, o excesso da enzima no periplasma causa a morte celular das hospedeiras. Em trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Tecnologias de DNA da UFAM um vetor denominado pULA foi construído a partir da obtenção da região promotora do pAC92, com operador restaurado, clonado em um vetor denominado de pUN, este sendo o pUC18 modificado sem o gene de β–galactosidase e sem sua região promotora/operadora de origem. O presente trabalho descreve a expressão da fosfatase alcalina de E. coli por meio do sistema de expressão regulável do pULA, assim como a purificação desta enzima. Dessa forma, o gene phoA foi subclonado no vetor pULA com sucesso, dando origem ao vetor pUNF, que se apresentou estável e funcional, regulado pela indução do IPTG. A melhor expressão da enzima no sistema em questão, ocorreu em meio com concentração de 0,05% de glicose, com um 1mM de IPTG e após 18 horas de indução.