Clonagem e expressão do gene da quitinase de Anopheles gambiae em Pichia pastoris
| Ano de defesa: | 2019 |
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| Autor(a) principal: | |
| Outros Autores: | |
| Orientador(a): | |
| Banca de defesa: | |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Tipo de acesso: | Acesso aberto |
| Idioma: | por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Federal do Amazonas
Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia |
| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: | |
| Link de acesso: | https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7286 |
Resumo: | Sendo integrante da classe das glicosídeo-hidrolases, as quitinases (EC 3.2.1.14) atuam na clivagem de sítios randômicos da molécula de quitina através de hidrólise, formando cadeias de quitooligossacarídeos. Estruturalmente possuem subdomínios catalíticos que a auxiliam na ligação ao seu substrato insolúvel e ruptura da conformação cristalina. O potencial enzimático dessas enzimas compreende principalmente o controle biológico de fito-patógenos fúngicos e insetos vetores, organismos onde a quitina é um componente estrutural da parede celular ou exoesqueletos. Entretanto, sua aplicabilidade se estende à síntese de polissacarídeos artificiais, isolamento de protoplastos fúngicos e estimativa de biomassa em processos industriais. A partir do sequenciamento do genoma de Anopheles gambiae foi obtido o gene atribuído a expressão de quitinase, de maneira que através de síntese química esse gene foi clonado em Escherichia coli (linhagem DH5α), e integrado ao genoma de Pichia pastoris nos vetores de expressão pPIC9 e pPICPGK. A atividade enzimática de 19 clones foi confirmada por análise do halo de degradação de quitina coloidal, e após a seleção foi realizada produção submersa em frascos agitados e caracterização bioquímica da enzima por delineamento central composto rotacional (DCCR). A clonagem e obtenção de vetores de expressão recombinantes foi consolidada de maneira que a integração ao genoma da levedura apresenta nível significante de expressão, na atividade enzimática fatores como tempo de incubação e temperatura não revelaram significância, e o fator pH se demonstrou com reposta positiva em faixas mais acídicas. |