PEPTÍDEOS DE PENETRAÇÃO CELULAR EM TRANSGÊNESE ANIMAL: PERSPECTIVA DE USO DA CROTAMINA EM EMBRIÕES BOVINOS

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: CAMPELO, IANA SALES
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual do Ceará
• Palavras-chave em Português: Medicina veterinária
• Link de acesso: https://siduece.uece.br/siduece/trabalhoAcademicoPublico.jsf?id=82223

<div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">RESUMO</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Em transgênese animal, diversos métodos já foram utilizados para a obtenção de crias, contudo todos eles apresentam baixa eficiência. Por isso, novas metodologias vêm sendo desenvolvidas. Nesse contexto, os peptídeos de penetração celular (PPCs) já foram testados como carreadores de DNA exógeno. A crotamina, um desses PPCs, é uma molécula obtida a partir do veneno de cascavel (Crotalus durissus terrificus) e possui a capacidade de interagir estavelmente a ácidos nucleicos por interação eletrostática (formando um complexo peptídeo-DNA). Assim, objetivo desse estudo foi verificar o potencial uso da crotamina, nas formas nativa e linear, como molécula carreadora de DNA exógeno para a produção de embriões bovinos transgênicos. Para tanto, foram realizados dois estudos. No primeiro, embriões foram expostos à crotamina nativa por diferentes intervalos de tempo para avaliar a sua penetração. Além disso, embriões fecundados in vitro (FIV) foram expostos ou microinjetados com complexo formado por crotamina nativa e DNA repórter para avaliação da transfecção. Quanto à penetração, imagens de microscopia confocal revelaram que a crotamina nativa foi captada pelos embriões após 1 h de exposição. Em relação à transfecção, a exposição e a microinjeção no espaço de perivitelino com complexo crotamina nativa-DNA não resultaram em embriões expressando o transgene, enquanto que a injeção intracitoplasmática de DNA apresentou taxas de expressão maiores do que a injeção intracitoplasmática de complexo crotamina nativa-DNA. Já no segundo estudo, inicialmente foi avaliada a capacidade da crotamina linear de complexar DNA em diferentes condições, usando crotamina nativa e lipofectamina como controles. Além disso, testamos a embriotoxicidade da crotamina linear expondo embriões bovinos FIV a diferentes concentrações do peptídeo por 6 h. Para avaliar a eficácia da crotamina linear em induzir a expressão de DNA exógeno, o complexo crotamina linear-DNA foi microinjetado em zigotos pós-FIV. Quanto à complexação, o complexo crotamina linear-DNA atingiu eficiências semelhantes nas proporções 1:100 e 1:50 (DNA: peptídeo) e a complexação foi maior do que os controles para esses grupos. Por isso, testamos proporções até 1:50 em diferentes intervalos de tempo. A complexação ocorreu muito rápido, pois pelo menos metade da complexação final (medida a 90 min) foi alcançada dentro dos 30 primeiros minutos para todos os grupos. Em relação à embriotoxicidade, todos os parâmetros de desenvolvimento embrionário registrados foram semelhantes comparados a embriões não-expostos. Assim, a exposição de zigotos não teve efeito sobre o desenvolvimento in vitro.</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Quanto à transfecção, ao utilizar o complexo crotamina linear-DNA não houve aumento na eficiência de produção de embriões expressando o gene repórter quando comparado com embriões microinjetados apenas com DNA. Desta forma, conclui-se que a crotamina nativa é capaz de translocar através da zona pelúcida de embriões bovinos. Por sua vez, a crotamina linear efetivamente forma um complexo com DNA sem apresentar embriotoxicidade detectável nas condições testadas. Provavelmente devido à elevada estabilidade de complexação entre as moléculas de DNA e esses peptídeos, o uso da crotamina tanto nativa quanto linear não melhorou a expressão de DNA exógeno em embriões bovinos.</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Palavras-chave: Bovino. Embrião. Peptídeo de penetração celular. Transgênese animal.</span></font></div>