PROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA COM POTENCIAL ANTIGÊNICO

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: DANTAS, TÂNIA VALESKA MEDEIROS
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual do Ceará
• Palavras-chave em Português: Vírus
• Link de acesso: https://siduece.uece.br/siduece/trabalhoAcademicoPublico.jsf?id=92726

<div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Em primeiro lugar procede a um levantamento dos principais estudos sobre proteínas</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">recombinantes e experimentos de vacinas contra o CAEV e outros lentivírus.</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Secundariamente visa a produzir uma proteína recombinante do vírus da artrite encefalite</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">caprina com potencial antigênico para ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">sorológicos em sistema de expressão bacteriana e em plasmídeo, No tocante ao primeiro</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">objetivo, foi realizada uma revisão de literatura das pesquisas nos últimos dez anos (1998-</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">2008) referente às vacinas contra lentivírus animal. No que concerne à produção da proteína</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">recombinante do CAEV, foi realizada uma análise do gene do CAEV para determinar qual a</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">região do gene gag codificava para a p28 do vírus. A região considerada foi dos nucleotídeos</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">971-1606 do CAEV Cork. Os oligos foram desenhados desde o inicio e final da sequência (20</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">e 21pb). Foi realizada a ligação do gene da p28 do gag em plasmídeo pUC19 e depois uma</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">subclonagem em pET32b. Realizaram-se o sequenciamento de ambas as construções e a</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">purificação por cromatografia de afinidade. Procedeu-se à PCR de colônia e à extração de</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">plasmídeos por lise alcalina. A melhor condição de expressão da proteína recombinante foi</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">testada a 37ºC e temperatura ambiente, utilizando como indutor o isopropil -D-1-</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">thiogalactopiranosidase (IPTG) nas concentrações de 0,5, 1 e 3mM. Para verificar o resultado</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">da expressão, as proteínas foram analisadas pela eletroforese em gel de poliacrilamida. Para</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">avaliar o seu potencial antigênico, foi efetuado o western blot, utilizando como antígeno a</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">proteína recombinante, e como anticorpo primário o soro de animal soropositivo. O</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">sequenciamento confirmou a correta inserção do fragmento do gene da p28 nos dois</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">plasmídeos, os quais apresentaram uma banda de 636 pb após a PCR na eletroforese em gel</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">de agarose. A bactéria E. coli expressou a proteína em diversas condições. A 37ºC a bactéria</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">expressou a proteína em menores intensidades e na concentração a 0,5 mM de IPTG, não</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">houve expressão. A temperatura ambiente, em todas as concentrações, a proteína foi expressa,</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">sendo que a 1 mM de IPTG apresentou maior intensidade. Com base nos resultados,</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">considerou-se a melhor condição de expressão da proteína p28 recombinante em E.coli BL21</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">o tratamento de 1 mM de IPTG a temperatura ambiente. Ao analisar o potencial antigênico da</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">proteína recombinante no western blot, essa reagiu com o soro positivo, apresentando forte</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">banda característica de peso moleular 28 kDa. Conclui-se que houve a produção da proteína</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">p28 do CAEV recombinante pela bactéria e essa apresenta um potencial antigênico que</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">provavelmente poderá ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos.</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Palavras -chaves: Lentivírus. Expressão de p28. Clonagem. Western Blot.Antigenicidade</span></font></div><div style=""><br/></div>