ESTRATÉGIAS PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES NA GLÂNDULA MAMÁRIA CAPRINA: EXPRESSÃO TRANSIENTE DE GLUCOCEREBROSIDASE HUMANA E USO DE CRISPR/CAS9 E RNA DE INTERFERÊNCIA PARA INSERÇÃO SÍTIO-DIRIGIDA DE TRANSGENE NO LOCUS ROSA26

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: TAVARES, KAIO CÉSAR SIMIANO
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual do Ceará
• Palavras-chave em Português: Biotecnologia
• Link de acesso: https://siduece.uece.br/siduece/trabalhoAcademicoPublico.jsf?id=86843

<div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">A produção de proteínas recombinantes utilizando organismos vivos, desde procariotos a eucariotos superiores, além da elevada relevância científica, movimenta um mercado econômico de alcance mundial. Proteínas mais complexas, que exigem modificações pós-traducionais essenciais ao seu funcionamento, exigem sistemas de produção mais evoluídos, como a glândula mamária. A proposta deste trabalho foi utilizar duas estratégias para a produção de proteínas recombinantes em caprinos: (a) através de vetores adenovirais, produzir glucocerebrosidase humana (hGCase) no leite de cabras não-transgênicas; e (b) associar as tecnologias de CRISPR/Cas9 e RNA de interferência para otimizar a taxa de integração sítio-dirigida de uma construção de DNA no locus ROSA26 caprino. Após a inoculação intramamária de um vetor adenoviral recombinante, foi possível detectar a secreção de hGCase recombinante durante seis dias no leite caprino, em um nível máximo de 111,1 ± 8.1 mg/L. A proteína teve sua identidade confirmada através de espectrometria de massas e demonstrou atividade biológica in vitro, através da clivagem específica de seu substrato. Sua massa molecular foi correspondente à proteoforma de hGCase contendo cadeias de oligossacarídeos terminadas em manose, o que pode facilitar a sua entrada nos macrófagos em um futuro uso para o tratamento da Doença de Gaucher. Esses resultados demonstraram o potencial da plataforma de expressão transiente de proteínas na glândula mamária de caprinos não-transgênicos como uma ferramenta rápida para produzir e caracterizar a hGCase produzida no leite. Em uma segunda estratégia, visando a produção de animais transgênicos com inserção do DNA exógeno sítio-dirigida, a utilização de CRISPR/Cas9 e RNA de interferência para a proteína KU70 em fibroblastos fetais propiciou a integração sítio dirigida de uma construção de 7.1 Kb no locus ROSA26 caprino. A integração ocorreu de forma bialélica no grupo transfectado com o vetor doador e CRISPR/Cas9 (4,5%) e de forma monoalélica, mas com maior eficiência, no grupo tratado com CRISPR/Cas9, vetor doador e RNA de interferência para KU70. O aumento de 2.8 vezes da taxa de integração do DNA por recombinação homóloga demonstra o potencial desta tecnologia para a produção de animais biorreatores para a produção de proteínas recombinantes no leite caprino, uma vez que as células com integração bialélica foram utilizados com sucesso para a clonagem por transferência nuclear de células somáticas, produzindo prenhezes viáveis (30,7%). Nossos resultados sugerem que a associação das duas metodologias utilizadas neste trabalho, expressão transiente de proteínas recombinantes na glândula mamária utilizando vetor adenoviral e produção de animais transgênicos por gene-targeting associado à clonagem</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">podem ser uma estratégia racional para a produção de biofármacos no leite, permitindo primeiramente uma caracterização rápida e de menor custo da proteína-alvo para posterior tomada de decisão para a geração de animais transgênicos com integração sítio-dirigida do DNA exógeno, o que pode minimizar possibilidades de silenciamento do transgene.</span></font></div><div style=""><font face="Arial, Verdana"><span style="font-size: 13.3333px;">Palavras-chave: Glucocerebrosidase. Adenovírus. CRISPR/Cas9. Gene-targeting. ROSA26.</span></font></div>