Caracterização genética, produção de biopolímeros extracelulares e proteoma de bactérias diazotróficas

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Oliveira, José de Paula
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual do Ceará
• Palavras-chave em Português: Biopolimero; Biotecnologia; Proteínas
• Link de acesso: https://siduece.uece.br/siduece/trabalhoAcademicoPublico.jsf?id=70678

Os exopolissacarídeos microbianos vêm sendo estudados cada vez mais devido as suas propriedades reológicas que em determinados casos superam as características funcionais dos polissacarídeos de origem vegetal, além das seguintes vantagens: produção independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de matériasprimas regionais, maior rapidez na obtenção do produto acabado e necessidade de espaço relativamente pequeno para a sua produção. Esse trabalho teve como objetivos caracterizar as estirpes IPA 403 e IPA 49 por análises da região 16S rDNA amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR); usada como padrão de Rhizobium tropici a estirpe CIAT 899 (CIAT – Colômbia); avaliar a produção de biopolímeros, composição química e reologia das estirpes citadas acima nos tempos de 132 , 144 e 168 horas de cultivo e identificar proteínas solúveis intracelulares por meio de técnicas de 2D - PAGE e espectrometria de massa no tempo de 168 horas de cultivo. As estirpes (IPA 403 e IPA 49) foram isoladas do Semi - Árido de Pernambuco – Região do Araripe foram realizadas através da comparação das sequencias parciais dos genes 16S rDNA. A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando os oligonucleotídeos iniciadores de reação Y1 e Y3 desenvolvidos para amplificação parcial do gene 16S rRNA de rizóbios. A reação de PCR foi conduzida em um termociclador com a seguinte programação: desnaturação inicial a 94o C por 2 min; 29 ciclos de desnaturação (94o C por 45 s), anelamento (50o C por 45 s) e extensão (72o C por 1 min) e uma extensão final a 72o C por 2 min. A recuperação dos biopolímeros foi realizada através da precipitação com álcool etílico (PA) na proporção de 1:3 (v/v) e a produção foi obtida avaliando-se a massa do produto seco por volume de meio de cultivo. A viscosidade foi determinada em um viscosímetro com taxa de cisalhamento variando entre 39,6 S-1 a 165 S-1 e viscosidade de 1,5 mPa.s. Foram realizados os teores de ácido pirúvico e acetil, e a composição química foi obtida através de cromatografia em camada delgada comparativa. Com base em 99 % de similaridade as análises das seqüências parciais do gene 16S rDNA confirmaram que as estirpes estudadas pertencem a espécie Rhizobium tropici. Quanto à produção de biopolímero a estirpe IPA 403 foi superior em relação às estirpes CIAT 899 e IPA 49, 25,44 g/L, 17,15 g/L e 11,25 g/L respectivamente, no tempo de 168 horas de cultivo. Com relação ao comportamento reológico dos biopolímeros produzidos a estirpe IPA 403 obteve a maior viscosidade (224 mPa.s.) entre as estirpes estudadas. Quanto a composição química dos biopolímeros a estirpe IPA 49 obteve a maior percentagem de acetil e ácido pirúvico, 5,60 % e 7,00 % respectivamente. Com relação aos teores de açucares presentes nos biopolímeros todas as estirpes apresentaram galactose e glicose. A fucose só foi identificada nas estirpes CIAT 899 e IPA 49 enquanto que o ácido urônico só foi detectado na estirpe IPA 403. A análise proteômica dos metabólitos produzidos pelas estirpes CIAT 899, IPA 403 e IPA 49 em 168 horas de cultivo apresentaram diversas proteínas dentre elas elongation factor TU, chaperona, GroEL / GroEs, glicosiltransferase (putative glycosyltransferase) que tem como uma das funções catalisar a produção de polissacarídeos. As dinitrogenase e nitrogenase ferro proteínas estão envolvidas no processo de redução do nitrogênio atmosférico fazendo parte do complexo da nitrogenase. A proteína glyceraldeideo-3-fosfato dehidrogenase do complexo energético está envolvida na glicólise, além de outras duas proteínas a eletron transfer flavoproteina beta subunit e dehidrogenase. Os resultados permitiram avaliar a qualidade do biopolímero produzido pelas estirpes utilizadas no experimento e de seu proteoma ao final de 168 horas de cultivo. Palavras chave: Rhizobium; exopolissacarídeos; 16S rDNA; composição química; proteoma.